延边奶山羊-绵羊体细胞克隆胚融合、激活条件的研究

摘要

异种间的体细胞克隆技术为保护和拯救珍稀濒危动物、人类器官移植开辟了一条崭新的途径，目前，虽然有种间体细胞核移植动物出生，但是较低的成功率限制了这项技术在实践中的应用。种间核移植仍面临着很大的困难，需要寻求适宜的供受体细胞组合及早期胚胎发育的环境。为了给动物种间核移植研究积累知识和经验，本实验对延边奶山羊-绵羊重构胚的融合、激活做了预先一步的研究。
　　本实验采用延边奶山羊耳皮肤成纤维细胞为供核细胞，以绵羊MⅡ期去核的卵母细胞为核移植受体，构建了山羊-绵羊异质重构胚。我们设计了一系列的试验以优化延边奶山羊-绵羊重构胚的融合激活效果，探讨了不同融合电场强度、脉冲次数、脉冲时程、融合后平衡时间、融合液浓度及激活方法对重构胚融合率及重构胚体外发育率的影响。
　　实验结果如下：
　　1、甘露醇浓度为0.25mol/L、0.28mol/L时重构胚的融合率（50.12％vs52.74%）和卵裂率（53.50%vs55.52%）差异不显著（P>0.05），但与0.30mol/L组相比差异显著（P<0.05），0.28 mol/L组的桑椹胚发育率（17.36%）明显高于其他两组，相比差异显著（P<0.05）；
　　2、电场强度为1000v/cm时重构胚的融合率与其它各组之间相比差异显著（P<0.05），电场强度为1200v/cm，1400v/cm以及1600v/cm时重构胚的融合率之间差异不显著（P>0.05）；1400v/cm的卵裂率（60.84%）和囊胚率（8.14%）最高，与1200 v/cm相比差异不显著（P>0.05），但与其他各组相比差异显著（P<0.05）；
　　3、2次脉冲的融合率与1次脉冲相比差异显著（P<0.05），但与3次电脉冲相比差异不显著（P>0.05）；2次脉冲的卵裂率（69.84%）和囊胚率（6.14%）显著的高于1次和3次脉冲，差异显著（P<0.05）；，但1次和3次脉冲之间差异不显著（P>0.05）。
　　4、脉冲时程为40μs时重组胚的融合率（65.56%）高于其他各组，但差异不显著（P>0.05），但是卵裂率（58.90%）与其他三组（10μs、20μs、80μs）相比差异显著（P<0.05）。脉冲时程为40μs的桑椹胚发育率为18.16%，与10μs组、80μs组相比差异显著（P<0.05），但与20μs组相比差异不显著（P>0.05）
　　5、30min、60min、90min、120min不同的平衡时间的融合率差异不显著（p>0.05），但90min组的卵裂率（70.62%）显著高于其他三组，相比差异显著（p<0.05）。90min组的囊胚率为8.10%，显著高于30min和120min组，但与60min组相比差异不显著（p>0.05）。
　　6、EH+CHX、EH+DMAP、Ion+CHX、Ion+DMAP四种激活方式卵裂率方面差异不显著，但是在桑椹胚发育率方面，Ion+6-DMAP组（21.30%）显著高于其他三组（18.90%、14.12%、15.34%），EH+CHX组与EH+6-DMAP组和Ion+6-DMAP组相比差异显著。EH+6-DMAP组和Ion+6-DMAP组之间差异不显著。

目录

声明

第一章 前 言

1.1异种间核移植技术

1.2融合和激活方法的研究现状

1.3本研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1仪器与材料

2.2实验方法

2.3实验设计

2.4 数据处理与统计分析

第三章 结果与分析

3.1融合液浓度对重构胚融合率及体外发育率的影响

3.2不同电场强度对重构胚融合率及体外发育率的影响

3.3不同电脉冲次数对重构胚融合率及体外发育率的影响

3.4不同脉冲时程对重构胚融合率及体外发育率的影响

3.5不同平衡时间对重构胚体外发育率的影响

3.6不同激活方法对重构胚体外发育率的影响

第四章 讨论

4.1融合液对重构胚融合率及体外发育的影响

4.2融合脉冲参数对重构胚融合率及体外发育的影响

4.3激活前不同平衡时间对重构胚体外发育的影响

4.4激活方法对重构胚体外发育的影响

第五章 结论

致谢

参考文献