延边黄牛体细胞克隆融合、激活条件的研究

摘要

面对愈来愈激烈的国际市场竞争形势，我国牛的品种还基本处于役用型或役肉兼用型和役乳兼用型的现状，这就决定了我国的牛产品很难在国际舞台上占有一席之地。进入21世纪以来，人们越来越感受到改良我国现有牛品种的迫切性，于是人们将视线转移到作为选种选育的一项高效新兴技术——体细胞克隆技术上来。 延边黄牛作为我国五大地方良种牛之一，具有不可多得的肉用品质，极具国际市场潜力，近年来它的保种选育工作要求越来越大的科技投入，为了加快其改良进程，提高选种选育效率，我们引入了体细胞克隆技术，为了这项工作的顺利开展，对其技术路线中的关键环节一融合、激活作预先一步的研究，从而保障该技术在延边黄牛保种选育工作中的成功应用。 本研究以新鲜的颗粒细胞作为供核细胞，以延边黄牛M Ⅱ期去核的卵母细胞作为受体，以挤压法去核，注入供体颗粒细胞到卵黄周隙中，甘露醇融合液中施加20gs时长的电脉冲刺激使之融合，复合化学方法激活，从融合前恢复时间、融合电场强度、甘露醇浓度、激活前恢复时间、激活方式和激活时间等六个方面着手研究了适宜延边黄牛体细胞克隆的融合、激活条件，结果以融合率、卵裂率、异常率、4-6细胞发育率和8-16细胞发育率计。结果如下： (1)2.0h的融合前恢复培养时间能够显著提高融合的效率及质量，融合率和异常率分别为80.8％和16.6％。 (2)使用1100V/cm的融合电场强度后，4-6细胞和8-16细胞的发育率分别为61.9％，32.3％，显著高于其它三组(P<0.05)。 (3)0.25M、0.27M、0.30M的甘露醇浓度在融合率、卵裂率、异常率及重组胚发育率方面均不存在差异。 (4)激活前恢复培养20min和25min，重组胚的卵裂率为67.6％和71.6％，异常率为33.6％和29.3％，是延边黄牛体细胞克隆理想的激活前恢复培养时间。 (5)采用离子霉素+6-DMAP的激活方式，重组胚卵裂率和8-16细胞发育率与其它三种方式没有差异，异常率和2-4细胞发育率分别为26.6％和60.7％。 (6)激活培养4h，重组胚8-16细胞发育率为39.8％，显著高于3h、6h组(P<0.05)，是延边黄牛体细胞克隆的最适合激活时间。 使用SPSS14.0软件对结果进行方差分析并多重比较后，综合考虑实验结果和方便操作时间与过程，得出以下结论：融合前恢复培养2h，采用0.30mol/L甘露醇作为融合液，在1100V/cm的电场强度下进行融合是适宜延边黄牛体细胞克隆的融合条件；激活前恢复培养20-25min，使用离子霉素作为激活试剂、6-DMAP作为辅助激活试剂，激活培养4h是延边黄牛体细胞克隆激活的理想条件。

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论文说明：缩略词表

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第一章绪论

1.1哺乳动物克隆研究的历史和现状

1.2延边黄牛体细胞克隆研究的目的及意义

1.3影响体细胞克隆效率的因素

1.4融合与激活方法的研究现状

第二章材料与方法

2.1仪器与材料

2.2实验方法

2.4统计分析方法

第三章结果与分析

3.1融合前恢复时间对融合率及重组胚体外发育的影响

3.2融合电场强度对融合率及重组胚体外发育的影响

3.3甘露醇浓度对融合率及重组胚体外发育的影响

3.4激活前恢复时间对重组胚体外发育的影响

3.5激活方式对重组胚体外发育的影响

3.6激活时间对重组胚体外发育的影响

第四章讨论

4.1影响融合效率的因素

4.2电融合条件对重组胚体外发育的影响

4.3影响激活效果的因素

4.4激活条件对重组胚体外发育的影响

第五章结论

致谢

参考文献