小鼠Sox2基因表达对P19干细胞向心肌细胞分化的影响

摘要

心肌坏死、瘢痕形成及心室重构是造成心脏功能恶化的主要因素，也是最终导致慢性充血性心力衰竭的主要病理基础。细胞移植治疗是治疗心脏疾病的一种新策略。而干细胞是细胞移植治疗最理想的种子细胞，因此，研究干细胞向心肌细胞分化的机理成为研究的热点和焦点，对细胞移植治疗心脏疾病具有重要的理论和临床意义。P19细胞是一种具有分化为心肌细胞倾向的干细胞系，将体外培养的心肌细胞注射到心肌梗死部位或冠脉灌流移植于心肌梗死区的细胞移植治疗，可以使病损区心肌重构，并改善衰竭心脏的功能。本实验探索干细胞向心肌细胞特异诱导分化的形态变化和心肌基因的表达变化，为心肌梗死干细胞移植治疗的基础研究提供一种良好的模型细胞。实验中采用二甲基亚砜(DMSO)体外分别诱导正常P19干细胞和经过siRNA干扰Sox2基因后的P19细胞向心肌细胞分化，对诱导培养后形成的细胞类胚体向心肌分化的过程进行检测。通过对细胞形态变化的观察、免疫组织化学染色以及RT-PCR测定不同时期细胞分化过程中的形态变化、心肌细胞表面特异标志物的表达和心肌细胞特异基因的表达。结果显示，经DMSO诱导形成的类胚体用生长培养液贴壁培养，贴壁后细胞由类胚体边缘开始分化，逐渐形成生长晕。细胞诱导4天可见梭形细胞，在10天时细胞团出现自发性节律跳动，在11天形成平行排列，细胞间彼此纵向相连。对分化5天的细胞进行测定，α-actin表达阳性，RT-PCR检测到心肌细胞特异表达基因，并且随着诱导分化的时间增长表达逐渐增加。经过干扰的P19干细胞诱导形成类胚体的能力下降，不能进行贴壁分化。本实验筛选出了有效的siRNA干扰片段，并对P19细胞多能性因子Sox2基因进行了干扰，发现Sox2缺失会对干细胞向心肌细胞诱导分化产生影响；本实验在制作类胚体的方法上进行了改进，采用一步悬浮培养的方法诱导形成类胚体，大大简化了繁琐的操作，并且形成的类胚体数量多，所用时间短，密度和大小均一，利于大批量进行细胞定向诱导分化实验：实验中对诱导分化时采用的DMSO诱导剂的浓度进行了筛选，得到了诱导分化时诱导剂使用的最佳浓度。

目录

文摘

英文文摘

声明

文献综述第一章Sox2基因的研究进展

1.1 Sox2基因的结构及其特征

1.1.1Sox2基因的结构

1.1.2 SOX2蛋白的特点

1.2 Sox2基因的功能

1.2.1 Sox基因家族其他成员的功能

1.2.2 Sox2基因在正常胚胎发育中的表达

1.2.3 Sox2基因缺失对胚胎发育的影响

1.3 Sox2基因的作用机理

1.3.1 Sox2基因与Oct4，Nanog之间的关系

1.3.2 Sox2/Oct4协同调控的分子机制

文献综述第二章RNA干扰研究进展

2.1 RNAi的分子机制

2.1.1 RNAi中所需的酶

2.1.2 RNAi作用机理

2.2 siRNA的制备

2.2.1化学合成法

2.2.2质粒载体介导的siRNA的制备

2.2.3病毒载体介导的siRNA的制备

2.3 RNAi在基因组研究方面的应用

2.4 RNAi在医学方面的应用

2.5利用RNAi技术在ESCs研究中的应用

文献综述第三章干细胞向心肌诱导分化的研究

3.1干细胞概述

3.1.1胚胎干细胞概述

3.1.2畸胎瘤干细胞概述

3.2干细胞向心肌细胞的诱导

3.2.1诱导分化的方法

3.2.2诱导分化的机制

3.3干细胞向心肌诱导分化的意义与应用

实验研究第四章pFlag-Sox2表达载体的构建

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法与步骤

4.2结果和分析

4.2.1 Sox2基因的克隆

4.2.2重组质粒pT-Sox2酶切鉴定及测序结果

4.2.3 Sox2基因真核表达载体pFlag-Sox2构建及鉴定

4.3讨论

4.3.1 Sox2基因克隆

4.3.2表达载体构建

4.4小结

实验研究第五章siRNA干扰Sox2基因对P19细胞分化的影响

前言

5.1材料和方法

5.1.1材料

5.1.2方法步骤

5.2结果与分析

5.2.1半定量RT-PCR检测siRNA干扰效果

5.2.2 siRNA转染P19细胞以及对P19细胞诱导类胚体的影响

5.3讨论

5.3.1 siRNA设计

5.3.2 siRNA干扰P19细胞Sox2基因

5.3.3 Sox2基因表达下降对于P19细胞的影响

5.4小结

实验研究第六章诱导P19细胞向心肌分化

6.1材料与方法

6.1.1材料

6.1.2方法与步骤

6.2.结果与分析

6.2.1细胞培养与诱导分化

6.2.2免疫组化分析

6.2.3心肌细胞表面标记物分析

6.3讨论

6.3.1 P19细胞的诱导分化

6.3.2心肌细胞特异基因检测

6.4小结

结 论

下一步工作设想

参考文献

致谢

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