玉米棉子糖合成酶基因克隆及玉米遗传转化

摘要

玉米是我国重要的粮食作物，但我国的干旱和盐渍土地严重影响玉米的产量。棉子糖家族系列寡糖（Raffinose Family Oligosaccharides:RFOs）在植物遭受逆境胁迫过程中大量积累，对植物抵御逆境胁迫起着积极的作用。 本实验室通过同源克隆方法在玉米中克隆到了唯一一个玉米棉子糖合成酶基因(ZmRS)。ZmRS基因的表达受到热激、脱水等非生物逆境胁迫的诱导，其突变后会影响种子活力。在拟南芥中超表达ZmRS基因能增强拟南芥对非生物逆境胁迫的耐受能力。 本研究将ZmRS基因进行了原核表达，并对ZmRS蛋白进行了纯化回收，用纯化的蛋白对兔子进行免疫，制备了ZmRS抗体。对抗体进行效价检测，显示ZmRS抗体能够检测出含量低至10 ng的ZmRS蛋白，且特异性较高。 构建了ZmRS基因的玉米超表达载体。将重组质粒转入玉米叶肉原生质体并提取总蛋白进行western-blot检测，经检测，转入ZmRS基因的玉米叶肉原生质体能高效表达ZmRS蛋白。将ZmRS基因玉米超表达载体转入农杆菌Agl1株系后，利用农杆菌介导的转化方法对玉米自交系A188的幼胚进行侵染。通过对转化材料的筛选和再生，最终获得18株再生植株，其中13株可育。 利用PCR方法对T1代植株进行鉴定，结果显示ZmRS cDNA已整合到玉米基因组。利用western-blot对转基因后代的ZmRS蛋白表达量进行鉴定，结果显示转基因玉米T1代幼苗中未检测到ZmRS蛋白。

目录

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摘要

第一章 文献综述

1．1 引言

1．2 棉子糖及其代谢通路

1．3 棉子糖与植物逆境耐受能力和种子活力密切相关

1．4 棉子糖抵御非生物逆境胁迫的作用机制

1．5 棉子糖代谢相关的酶

1．5．1 肌醇半乳糖苷合成酶

1．5．2 棉子糖合成酶

1．6 玉米遗传转化研究进展

1．7 研究目的和意义

第二章 材料方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株和载体

2．1．3 主要试剂

2．2 实验方法

2．2．1 基因扩增及载体构建

2．2．2 玉米叶肉原生质体的制备及其转化

2．2．3 原核表达与蛋白纯化

2．2．4 多克隆抗体制备

2．2．5 农杆菌侵染法转化玉米幼胚及再生植株的获得

2．2．6 转基因植株鉴定

第三章 实验结果与分析

3．1 ZmRS基因的同源克隆

3．2 载体的构建及检测

3．3 玉米棉子糖原核表达及蛋白纯化

3．4 抗体的制备及检测

3．5 ZmRS玉米超表达载体表达效率鉴定

3．6 农杆菌转化玉米幼胚及转基因植株再生

3．7 再生玉米植株PCR鉴定

3．8 再生玉米T1代幼苗western-blot鉴定

第四章 讨论

4．1 ZmRS蛋白原核表达及其纯化

4．2 ZmRS蛋白抗体的制备

4．3 玉米转化

4．4 利用western-blot分析不同株系ZmRS蛋白表达量

参考文献

附录

缩略表

致谢

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