肠道稳定型牛腺病毒载体的构建及体外评价

摘要

牛腺病毒1型(BAdV-1)和3型(BAdV-3)分别为牛肠道和呼吸道常在病毒，因其本身不具致病性，生物安全性高，转导效率高，以及本身强大的递送和佐剂功能，近年来受到人们的广泛关注。在已报道的牛腺病毒中，BAdV-3研究的最为详细并已广泛用于载体疫苗研究。但是BAdV-3属呼吸道腺病毒，不耐受胃肠道的极端环境限制了其作为载体在口服疫苗研究中的应用。BAdV-1虽为嗜肠型腺病毒，具有良好的肠道稳定性，但由于其作为疫苗载体研究的相对落后，目前尚无报道的BAdV-1疫苗载体可用。考虑到牛腺病毒在开发牛口服载体疫苗领域的天然优势，本研究通过以下两种途径尝试构建具有口服疫苗载体潜力的重组BAdV-3和BAdV-1病毒。
　　1.本研究利用BJ5183同源重组系统将BAdV-3 fiber顶端的knob区替换为BAdV-1 fiber顶端的knob区成功拯救出与wtBAdV3增殖能力相近的嵌合病毒rBAdV3-B1F，并证明该嵌合病毒可以逃逸BAdV-3阳性血清的中和。但是该重组病毒易受低pH、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶的影响，这些结果说明重组病毒的肠道稳定性并没有显著提高。
　　2.本研究对BAdV1进行改造，通过在BAdV1的E3区引入标记基因EYFP，成功拯救出重组病毒rBAdV1-EYFP。通过PCR和Western blotting方法证明重组病毒rBAdV1-EYFP在体外能稳定传代。中和试验结果表明wtBAdV1及rBAdV1-EYFP的中和效价一致。重组病毒rBAdV1-EYFP在盐酸(pH=2)中处理之后发现，与wtBAdV1类似，重组病毒rBAdV1-EYFP可以耐受高浓度的盐酸。同时，在pH、胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶混合存在的情况下，重组病毒rBAdV1-EYFP的存活率要高于野生型病毒wtBAdV1。
　　本研究尝试构建具有肠道稳定性的牛腺病毒载体。通过对wtBAdV3的fiber蛋白的knob区进行替换，发现重组病毒的肠道稳定性并没有提高，说明这一方法不可行。我们进一步对嗜肠型牛腺病毒wtBAdV1进行改造，构建了带有标记基因EYFP的重组牛1型腺病毒rBAdV1-EYFP，并证明该重组病毒可以耐受高浓度的盐酸，这些结果为开发具有肠道稳定性的牛腺病毒疫苗载体奠定了良好的基础。

目录

声明

摘要

第一章 腺病毒研究进展

1．1 腺病毒

1．1．1 腺病毒的结构特征

1．1．2 腺病毒的分类

1．1．3 牛腺病毒

1．2 Fiber蛋白

1．2．1 Fiber的结构

1．2．2 Fiber蛋白的功能研究

第二章 重组牛腺病毒rBAdV3-B1F的研究

2．1 材料与方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．2 穿梭质粒pUC10819 BAV1 fiber的构建及鉴定

2．2．3 重组载体pUCBAV304a-B1F的构建及鉴定

2．2．4 重组牛腺病毒rBAdV3-B1F的包装及鉴定

2．2．5 重组牛腺病毒的增殖特性

2．2．6 病毒转导试验

2．2．7 病毒中和试验

2．2．8 病毒对盐酸及蛋白酶敏感性的研究

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 表达标记基因重组牛1型腺病毒载体的构建

3．1 材料与方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 穿梭质粒pBAV1-kan-EYFP的构建及鉴定

3．2．2 重组载体pUCBAV1-EYFP的构建及鉴定

3．2．3 重组牛腺病毒rBAdV1-EYFP的拯救及扩增

3．2．4 重组牛腺病毒的增殖特性

3．2．5 重组牛腺病毒rBAdV1-EYFP遗传稳定性的检测

3．2．6 血清中和试验

3．2．7 病毒对盐酸及蛋白酶敏感性的研究

3．3 讨论

3．4 小结

结论

参考文献

附录

致谢

作者简介