植物乳杆菌细菌素基因座遗传分析与基因plnEF外源表达研究

摘要

植物乳杆菌可以适应恶劣的葡萄酒环境，启动苹果酸-乳酸发酵，具有产生植物乳杆菌细菌素的能力，抑制或杀死葡萄酒中有害乳酸菌，防止葡萄酒的破败，部分替代二氧化硫的作用，从而降低葡萄酒中二氧化硫的使用。因此筛选产细菌素的植物乳杆菌进行苹果酸-乳酸发酵，十分必要。
　　本试验首先通过共培养诱导培养产生细菌素，从14株植物乳杆菌中成功筛选获得两株产细菌素的植物乳杆菌XJ25和PC520。其次，利用两株菌基因组重测序手段，进一步比较分析其植物乳杆菌素（Plantaricin，pln）基因座间存在的差异，获得植物乳杆菌素pln基因座遗传图谱。最后构建基因plnE和plnF的外源表达载体，诱导产生大量重组蛋白，并对其进行初步的纯化。主要研究结果如下:
　　1)14株植物乳杆菌中，菌株XJ25和PC520抑菌范围大，抑菌性较强，且对醋酸菌有一定的抑制作用;植物乳杆菌中共培养现象是普遍存在的，菌株X J25和PC520与粪肠球菌XJ26M共培养诱导产生细菌素。通过对7株乳酸菌(XJA2，201，205，216，509，594，542)进行16SrRNA及recA基因的扩增分析，鉴定7株菌为植物乳杆菌，并且RAPD分析12株植物乳杆菌随机扩增片段的多态性，表明了其基因组DNA的多态性。
　　2)菌株XJ25和PC520的pln基因座结构相似，均由6个操纵子(plnEFI、plnJKLR、plnGHSTUVW、plnABCD、plnMNOP、plnWXY)组成，其中plnABCD是三组分调节操纵子。并且菌株X J25和PC520均存在一个新的未知功能的or f1。植物乳杆菌菌株PC520的部分基因(plnY，plnS)等发生缺失，菌株XJ25的plnF基因编码蛋白在14位(A-S)和42位(V-I)有两个氨基酸突变。
　　3)通过一步定向克隆技术，引物设计与线性质粒两端同源片段，成功将目的片段插入质粒中，转化的效率很高。优化重组蛋白诱导表达条件，选择在18℃，150rpm，IPTG浓度0.6mM，诱导时间12h，进行扩大培养。
　　4)重组蛋白PlnE，PlnF1，PlnF2经AKTA蛋白纯化分析，超滤脱盐等，去除部分杂蛋白，所测蛋白浓度为600-1000ng/μl，仍需进一步纯化;纯化后蛋白进行抑菌活性检测表明，重组蛋白PlnE和PlnF具有抑菌活性，且蛋白PlnE和蛋白PlnF之间存在协同作用。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 乳酸菌

1．1．1 乳酸菌分型

1．1．2 酶类多样性

1．2 细菌素

1．2．1 细菌素与细胞膜作用机制

1．2．2 共培养诱导及调控机制

1．3 PlnE和PlnF相互作用

1．4 研究目的和内容

1．4．1 研究目的及意义

1．4．2 研究内容

1．5 技术路线

第二章 共诱导产细菌素菌株的筛选

2．1 试验材料

2．1．1 菌株

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂

2．1．4 仪器

2．2 试验方法

2．2．1 抑菌活性测定

2．2．2 共诱导培养

2．2．3 16S rRNA基因扩增及RAPD分析

2．3 试验结果

2．3．1 产细菌素植物乳杆菌的初筛

2．3．2 共培养诱导产细菌素

2．3．3 16S rRNA基因扩增及RAPD分析

2．4 本章小结

第三章 植物乳杆菌细菌素基因座遗传分析

3．1 试验材料

3．1．1 菌株

3．1．2 试剂

3．2．2 基因组重测序

3．2．3 植物乳杆菌素pln基因座分析

3．3 试验结果

3．3．1 基因组重测序

3．3．2 植物乳杆菌XJ25和PC520的pln基因座遗传分析

3．4 本章小结

第四章 抗菌肽PlnE和PlnF原核表达

4．1 试验材料

4．1．1 菌株及质粒

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器

4．2 试验方法

4．2．1 目的基因引物设计及合成

4．2．2 目的片段PCR扩增

4．2．3 质粒双酶切

4．2．4 目的片段与质粒重组反应

4．2．5 反应产物转化及克隆鉴定

4．2．6 重组蛋白诱导表达

4．3 试验结果

4．3．2 质粒载体双酶切

4．3．3 阳性克隆结果及测序

4．3．4 Tricine-SDS-PAGE电泳

4．4 本章小结

第五章 重组蛋白PlnE和PlnF纯化及抑菌活性检测

5．1 试验材料

5．1．1 菌株

5．1．2 试剂

5．1．3 仪器

5．2 试验方法

5．2．1 诱导条件优化

5．2．2 重组蛋白大量诱导

5．2．3 AKTA蛋白层析纯化

5．2．4 蛋白超滤脱盐

5．2．5 BCA法测定重组蛋白浓度

5．2．6 重组蛋白抑菌活性检测

5．3 试验结果

5．3．1 诱导条件优化

5．3．2 蛋白纯化及脱盐处理

5．3．3 抑菌活性检测

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

参考文献

附录

致谢

作者简介