苹果蠹蛾嗅觉蛋白的鉴定与组织分布研究

摘要

苹果蠹蛾Cydia pomonella(L.)是世界范围分布的重要果树害虫，以幼虫钻蛀果实为害，造成苹果、梨等水果的商品价值降低甚至丧失经济价值。苹果蠹蛾成虫具有发达的嗅觉系统，能够感知雌虫释放的性信息素和种类繁多的寄主植物挥发物。利用苹果蠹蛾的嗅觉，通过人工合成的性信息素和植物挥发物治理苹果蠹蛾高效且安全，取得了很好的经济效益和社会效益。
　　昆虫嗅觉包括发生在嗅觉感器中的外围嗅觉活动和中枢神经层面的嗅觉信号处理。气味结合蛋白(OBPs)、化学感受蛋白(CSPs)、气味降解酶(ODEs)、感觉神经元膜蛋白(SNMPs)和气味受体(ORs)分布于嗅觉感器，参与了将气味分子携带的化学信号转换为嗅觉电位信号的生理过程，是昆虫外围嗅觉活动的分子基础。本研究通过分析苹果蠹蛾成虫转录组，鉴定得到47个候选的嗅觉蛋白。其中2个OBPs、1个CSPs、2个SNMPs和30个候选ODEs在苹果蠹蛾成虫触角中表达。结合已报道的苹果蠹蛾ORs，初步描述了苹果蠹蛾外围嗅觉活动的生化进程:进入嗅觉感器的气味分子由CpomOBPs和CpomCSPs结合并转运穿过感器血淋巴到达嗅觉神经元;气味分子被CpomORs识别并产生嗅觉电位信号(性信息素的识别还需要CpomSNMPs协助);最后，失去时效性的气味分子被苹果蠹蛾ODEs降解。主要研究成果如下:
　　1.在苹果蠹蛾中鉴定得到2个OBPs和3个CSPs。其中CpomOBP13、CpomOBP14和CpomCSP13在苹果蠹蛾成虫触角中分布。CpomOBP13氨基酸序列包含6个保守的半胱氨酸残基，氮端起始的19个氨基酸残基形成一段信号肽序列，属于传统OBPs(Classic OBPs);CpomOBP14也包含一段信号肽序列，除了包含与CpomOBP13同源的6个保守半胱氨酸残基之外，还包含6个碳端的保守半胱氨酸残基，属于Plus-C OBPs。CpomCSP13、CpomCSP14和CpomCSP15均包含信号肽序列和4个保守的半胱氨酸残基。在触角中表达的CpomOBP13、CpomOBP14和CpomCSP13与其他鳞翅目嗅觉功能OBPs和CSPs亲缘关系较近。信号肽的存在说明它们属于分泌型蛋白，分布于血淋巴中;保守的半胱氨酸与二硫键的形成有关，对蛋白形成特定空间结构有重要作用。
　　2.克隆得到2个苹果蠹蛾SNMPs。CpomSNMP1和CpomSNMP2属于跨膜蛋白，含有两个跨膜区域和一个细胞外环结构，胞外环结构中的6个保守半胱氨酸参与了二硫键的形成。系统发育分析表明，昆虫SNMPs分为SNMP1和SNMP2两个亚族，CpomSNMP1和CpomSNMP2分别位于鳞翅目昆虫的SNMP1和SNMP2所在分支。组织分布上，CpomSNMP1仅在苹果蠹蛾成虫触角中表达，且在雄虫触角中的表达量高于雌虫，CpomSNMP2也是触角特异性蛋白，但在雌、雄虫触角中的表达水平相当。我们制备了CpomSNMP2多克隆抗体用于研究CpomSNMP2在苹果蠹蛾触角上的组织分布情况，CpomSNMP2定位于苹果蠹蛾的毛形感器和刺形感器。说明CpomSNMP2与苹果蠹蛾嗅觉功能紧密相关。
　　3.鉴定得到的苹果蠹蛾生物转化酶中，12个羧酸酯酶(CXEs)、2个醛氧化酶(AOXs)和6个醇脱氢酶(ADs)在触角中分布。CpomCXEs包含保守的催化三分子“Ser-His-Glu”和催化活性中心“Gly Xxx Ser Xxx Gly”;CpomAOXs具有两个铁硫氧化还原中心、一个FAD结合区域和一个钼离子/底物结合区域;CpomADs来自不同的蛋白家族，包括短链脱氢酶、中链脱氢酶和醛酮还原酶，分别包含各自蛋白家族的催化活性位点和辅酶结合位点。系统发育分析表明，这些触角生物转化酶与其他昆虫的ODEs或抗性相关酶亲缘关系近。苹果蠹蛾能够感知脂类、醇类、醛类等各种挥发性气味分子，在触角中分布的CXEs、AOXs和ADs可能参与了气味分子的降解。
　　4.GSTs是昆虫体内重要的多功能生物转化酶。鉴定得到的苹果蠹蛾谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)包括12个胞质GSTs和2个微粒体GSTs。每个胞质GSTs均包含一个保守的氮端还原型谷胱甘肽(GSH)结合区域和一个高度变异的碳端底物结合区域;而微粒体GSTs具有3个跨膜区域和一个由16个氨基酸残基组成的保守主题序列。8个苹果蠹蛾胞质GSTs和2个微粒体GSTs在成虫触角中分布;其中在触角上特异性表达的CpomGSTd2是具有信号肽序列的特殊GSTs;这些在苹果蠹蛾触角中表达的GSTs，尤其是CpomGSTd2，可能参与了嗅觉信号的终止。进一步的活性检测实验表明，CpomGSTd2重组蛋白在25-50℃的温度范围内具有很高的GST催化活性，最适pH为7.0。毒死蜱、辛硫磷、灭幼脲和β-氟氯氰菊酯能够抑制GSTd2的催化活性，表明杀虫剂能够通过抑制嗅觉蛋白的活性对昆虫的嗅觉系统产生影响。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 昆虫嗅觉

1．2 昆虫嗅觉蛋白

1．2．1 昆虫气味结合蛋白

1．2．2 昆虫化学感受蛋白

1．2．3 昆虫神经元膜蛋白

1．2．4 气味降解酶

1．3 苹果蠹蛾

1．3．1 苹果蠹蛾嗅觉

1．3．2 苹果蠹蛾嗅觉蛋白

1．4 研究设想

第二章 苹果蠹蛾气味结合蛋白和化学感受蛋白的鉴定与组织分布

2．1 试验材料

2．1．1 供试昆虫

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 总RNA提取与cDNA第一链合成

2．2．3 系统发育分析

2．2．4 组织分布

2．3 实验结果

2．3．1 苹果蠹蛾OBPs秘CSPs的鉴定与序列分析

2．3．2 苹果蠹蛾OBPs和CSPs表达模式

2．4 讨论

第三章 苹果蠹蛾感觉神经元膜蛋白的鉴定与组织分布

3．1 实验材料

3．1．1 供试动物

3．1．2 主要试剂

3．1．3 缓冲液配制

3．1．4 主要仪器

3．2 试验方法

3．2．1 RNA提取与cDNA第一链合成

3．2．2 基因鉴定与序列分析

3．2．3 系统发育分析

3．2．4 苹果蠹蛾SNMPs基因克隆

3．2．5 苹果蠹蛾SNMPs组织分布及相对表达水平

3．2．6 苹果蠹蛾SNMP2的原核表达

3．2．7 多克隆抗体制备

3．2．8 荧光免疫定位

3．2．9 扫描电镜观察

3．3．1 苹果蠹蛾SNMP2的鉴定与分析

3．3．2 苹果蠹蛾SNMPs组织分布

3．3．3 苹果蠹蛾SNMPs在触角上的定位

3．4 讨论

第四章 苹果蠹蛾触角生物转化酶的鉴定与组织分布

4．1 实验材料

4．1．1 供试昆虫

4．1．2 主要试剂

4．1．3 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 RNA提取与cDNA第一链合成

4．2．2 基因鉴定与序列分析

4．2．3 系统发育分析

4．2．4 组织分布

4．3 实验结果

4．3．1 苹果蠹蛾生物转化酶的鉴定

4．3．2 苹果蠹蛾羧酸酯酶

4．3．3 苹果蠹蛾醛氧化酶

4．3．4 苹果蠹蛾醇脱氢酶

4．3．5 苹果蠹蛾生物转化酶组织分布

4．4 讨论

第五章 苹果蠹蛾谷胱甘肽S-转移酶的鉴定与组织分布

5．1 实验材料

5．1．1 供试昆虫

5．1．2 主要试剂

5．1．3 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 RNA提取与cDNA第一链合成

5．2．2 基因的鉴定与序列分析

5．2．3 系统发育分析

5．2．4 组织分布

5．3 实验结果

5．3．1 苹果蠹蛾胞质GSTs的鉴定与序列分析

5．3．2 苹果蠹蛾微粒体GSTs的鉴定与序列分析

5．3．3 苹果蠹蛾GSTs组织分布

5．4 讨论

第六章 苹果蠹蛾GSTd2的表达与活性检测

6．1 实验材料

6．1．1 供试昆虫

6．1．2 主要试剂

6．1．3 缓冲液配制

6．1．4 主要仪器

6．2 试验方法

6．2．1 RNA提取与cDNA第一链合成

6．2．2 苹果蠹蛾GSTd2原核表达

6．2．3 酶活检测

6．2．4 最适pH和热稳定性检测

6．2．5 杀虫剂对苹果蠹蛾GSTd2重组蛋白活性的影响

6．2．6 数据分析

6．3 实验结果

6．3．1 重组蛋白纯化

6．3．2 苹果蠹蛾GSTd2酶活检测

6．3．3 杀虫剂对苹果蠹蛾GSTd2活性的影响

6．4 讨论

第七章 结论与展望

7．1 结论

7．2 展望

参考文献

附录

致谢

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