一种苹果蠹蛾鉴定引物及鉴定方法与应用

摘要

本发明涉及一种苹果蠹蛾鉴定引物，引物1F：5’-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3’；引物1R：5’-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3’。使用上述引物鉴定苹果蠹蛾的方法，包括以下步骤：(1)待鉴定样品DNA模板的提取；(2)使用权利要求1所述苹果蠹蛾鉴定引物对模板DNA进行PCR扩增；(3)电泳检测有无289bp条带。本发明提供的苹果蠹蛾鉴定引物对苹果蠹蛾的目的片段具有良好的扩增效果，用于鉴定时仅根据289bp条带的有无，即可对样本进行鉴定，快速简便、结果清晰、准确。

说明书

技术领域

本发明涉及一种苹果蠹蛾鉴定引物及利用该特异性鉴定引物对待鉴定样品进行快速鉴定识别苹果蠹蛾的方法，本发明还涉及上述苹果蠹蛾鉴定引物在区分苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫上的应用。

背景技术

苹果蠹蛾Cydia pomonella L.，异名Laspeyresia Pomonolla L.，俗称苹果小卷蛾，属鳞翅目，卷蛾科，主要危害苹果、梨、沙果、海棠、李、桃、山楂等多种果树，是仁果和核果类果树的毁灭性害虫，属世界性检疫有害生物。该虫以幼虫蛀果为害，造成大量虫果，严重影响果实的品质；幼虫还有转果危害的习性，导致果实采收前大量落果和腐烂，幼虫的蛀果率通常在50％左右，严重时可达70％-100％。苹果蠹蛾原产欧洲东南部，现已遍及全世界69个国家和地区。50年代，该虫于我国新疆被发现；80年代中期已进入甘肃省敦煌和酒泉地区；2006年进入山丹，且有进一步向东扩展的趋势。如果苹果蠹蛾蔓延到陕西、山东等苹果大省，我国的苹果出口将会受到限制，经济损失将会极其严重。因此，进一步提高对苹果蠹蛾的识别、鉴定能力对于防止外来入侵害虫苹果蠹蛾在我国进一步扩展具有重要意义，而苹果蠹蛾的快速鉴定方法也成为防止苹果蠹蛾进一步入侵的重要手段。

桃小食心虫Carposina sasakii、梨小食心虫Grapholitha molestaBusck和李小食心虫Grapholita funebrana为我国常见的3种食心虫，此3种食心虫的低龄幼虫与苹果蠹蛾幼虫在外部形态上非常相似，没有显著差异。目前，我国检疫部门对苹果蠹蛾的分类鉴定主要是以老熟幼虫或成虫的外部形态特征作为依据。但在口岸实际检疫工作中，截获的往往是低龄幼虫或卵，通常的作法是对其进行室内饲养待获得老熟幼虫后再进行鉴定，这样不仅延长了进出口物品的通关时间，而且增加了检疫人员的工作强度。因此对苹果蠹蛾进行准确快速的鉴定，无论是在口岸检疫上还是在防治上都具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种苹果蠹蛾鉴定引物、使用该鉴定引物鉴定苹果蠹蛾的方法及该鉴定引物在区分苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫上的应用。

本发明首先提供了一种苹果蠹蛾鉴定引物，所述鉴定引物的序列为：

引物1F：5′-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3′，

引物1R：5′-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3′，

该引物能够扩增出一条289bp的片段。本发明利用COI通用引物对采自全国不同地区的苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫样本进行PCR扩增，测序得到长度为502bp的序列，将4种食心虫的COI序列用CLUSTALX软件进行对比，找出苹果蠹蛾与其它3种食心虫的差异位点，利用Primer5.0软件设计引物，并利用Blast程序检验引物特异性，从而设计出针对苹果蠹蛾的特异性鉴定引物。来自全国10个地区的苹果蠹蛾样本在使用上述引物F/R时均能扩增出289bp的明亮条带，而桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫样本在使用上述引物时则不能扩增出条带。

本发明还提供了一种使用上述苹果蠹蛾鉴定引物鉴定苹果蠹蛾的方法，包括以下步骤：

(a).待鉴定样品DNA模板的提取；

(b).使用权利要求1所述苹果蠹蛾鉴定引物对模板DNA进行PCR扩增；

(c).电泳检测有无289bp条带。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(a)中，待鉴定样品DNA模板的提取方法为盐析法。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(a)中，所述盐析法包括以下步骤：

(1).酒精保存的待鉴定样品，除去酒精后，晾干；

(2).晾干的样本转移至装有提取液的离心管中充分研磨；

(3).将匀浆移至60～70℃水浴15～30min；

(4).在匀浆中加入NaAc，冰浴；

(5).冰浴后的混合液离心；

(6).上青液转移至另一离心管中，加入等体积异丙醇后，离心，弃上清液；

(7).向留有沉淀的离心管中加入70％乙醇洗涤DNA，离心，弃上清；

(8).步骤(7)重复1～2次；

(9).自然晾干后，向离心管中加入无菌水溶解DNA，冷冻保存。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(4)中，所述NaAC为8mol/I的冷NaAc，冰浴时间10～20min；步骤(9)中，所述冷冻保存的温度是-20℃。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(2)中，所述提取液由0.2M蔗糖、0.1M Tris、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.5％SDS配制成，pH8.5～9.5。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(5)和(6)中，所述离心于4℃下，以10000rp/min的速度离心15～20min；步骤(7)中，所述离心于4℃下，以10000rp/min的速度离心4～6min。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(b)中，所述PCR扩增的条件为常规PCR体系，退火温度为55℃～57℃，退火时间为30s。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，步骤(c)中，所述电泳检测为1～1.5％(质量百分比)琼脂糖凝胶电泳检测。

作为优选，上述鉴定苹果蠹蛾的方法，上述电泳检测利用紫外光检测电泳结果。

本发明还进一步提供了上述苹果蠹蛾鉴定引物在区分苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫上的应用。

本发明提供的苹果蠹蛾鉴定引物结构简单，对苹果蠹蛾的目的片段具有良好的扩增效果；利用该特异性引物鉴定区分苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫时，快速简便，鉴定结果准确，PCR反应为常规条件，成功率高；实验结果以电泳图的形式呈现，仅根据289bp条带的有无，即可对样本进行鉴定，结果清晰明了，不需对低龄幼虫或卵进行室内饲养至老熟幼虫后再进行鉴定。本发明提供的苹果蠹蛾鉴定引物及利用该引物鉴定苹果蠹蛾应用到口岸实际检疫工作中，不仅能大大缩短进出口物品的通关时间，而且还能降低检疫人员的工作强度。

附图说明

图1为苹果蠹蛾特异引物对采集自我国不同地区的10份苹果蠹蛾样本总DNA的扩增结果。图1中，

M为marker；

1-10依次为采集自甘肃张掖、酒泉、敦煌，新疆哈密、乌鲁木齐、库尔勒、喀什、奎屯、精河、伊犁的苹果蠹蛾样本；

11-15依次为采集自甘肃平凉、张掖，陕西杨凌、凤县，辽宁沈阳的桃小食心虫样本；

16-19依次为采集自甘肃张掖，新疆乌鲁木齐、喀什，陕西杨凌的梨小食心虫样本；

20-22依次为采集自新疆乌鲁木齐、奎屯、喀什的李小食心虫样本。

序列表说明

序列表1为甘肃、新疆两省6个地区苹果蠹蛾与美国、白俄罗斯、澳大利亚、德国4地苹果蠹蛾COI序列比对。其中，GS-JQ代表甘肃酒泉，GS-DH代表甘肃敦煌，XJ-HM代表新疆哈密，XJ-KEL代表新疆库尔勒，XJ-KS代表新疆喀什，XJ-YL代表新疆伊犁。

序列表2为苹果蠹蛾与梨小食心虫、李小食心虫和桃小食心虫COI序列的比对。框中为特异性苹果蠹蛾鉴定引物的所在位置。

具体实施方式

本发明基于目前的分子生物学技术手段，从待鉴定样品的DNA模板提取、苹果蠹蛾特异引物设计和电泳图谱的获得三方面入手，通过开发新的方法以达到使苹果蠹蛾的鉴定方法更加简单、快速、准确的目的。

其中待鉴定样品DNA模板的提取方法为盐析法，具体步骤如下：

1.随机挑选单头食心虫标本(纯酒精保存)，幼虫取头部，成虫取足或胸部肌肉；样本取出后浸入无菌水中除去酒精，并在吸水纸上晾干；

2.样本晾干后转移至装有100μL提取液的1.5ml离心管中充分研磨；

3.将匀浆移至60～70℃水浴15-30min；

4.在匀浆中加入10μL冷的8mol/LNaAc，冰浴15min；

5.将冰浴后的混合液4℃，10000rp/min，离心20min；

6.上清液转移至另一1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，10000rp/min离心15min，弃上清；

7.向留有沉淀的离心管中加入70％乙醇1ml洗涤DNA，10000rp/min离心5min，弃上清；

8.步骤7重复1～2次。

9.自然晾干后向管内加入50μL无菌水溶解DNA，-20℃冰箱内保存备用。

电泳检测使用的琼脂糖凝胶电泳为常规方法。

苹果蠹蛾鉴定引物的设计为本发明的核心，为了得到对苹果蠹蛾特异而准确的鉴定引物，我们进行了以下研究：

1.苹果蠹蛾COI基因种内保守性研究：通过采集中国甘肃、新疆两省共6个地区的苹果蠹蛾成虫及幼虫标本，以COI通用引物：

mtD7.2F 5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3′

mtD9.2R 5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′

经过常规PCR扩增和常规测序得到苹果蠹蛾线粒体基因COI片段序列。

同时，我们还从NCBI上搜索4条苹果蠹蛾相关序列，序列号分别为FJ217763、FJ217761、FJ217754、FJ217752，序列相关标本分别来源于美国、白俄罗斯、澳大利亚和德国。用CLUSTAL X软件对上述的苹果蠹蛾COI序列进行比对，发现不同来源的苹果蠹蛾在COI区域的保守性很高，从而保证了引物的准确性(序列表1)。

2.桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫COI基因种内保守性研究：通过采集中国不同地区的桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫成虫及幼虫标本，以COI通用引物：

mtD72F 5′-GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3′

mtD9.2R 5′-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3′

经过常规PCR扩增和常规测序得到此3种食心虫COI片段序列。

同时，我们还从NCBI上搜索了此3种食心虫的相关序列，通过对上述3种食心虫COI序列分别进行比对，发现3种食心虫的COI区域均具有很高的保守性。

3.苹果蠹蛾与其它三种食心虫(桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫)的COI序列比对：为了设计出针对苹果蠹蛾的特异引物，我们对4种食心虫的COI序列进行了比对(序列表2)。

通过序列表1、序列表2可以看出，设计苹果蠹蛾特异引物所选取的区域为种间变异区，该区域存在一定的碱基差异，而在种内又十分保守，因此，该区域序列可以作为苹果蠹蛾的特异引物。

4.通过PCR扩增实验验证苹果蠹蛾特异引物的特异性及对苹果蠹蛾目的片段的扩增效果，具体步骤如下：

(1)PCR反应体系：反应体系以50μL为参考，引物用去离子水调至10pmol/μL，各试剂用量分别为：

10×TaqDNA聚合酶缓冲液(Mg²⁺)    5μL

dNTP(10mM)                      4μL

引物1F                          1μL

引物1R                          1μL

模板DNA                         4μL

TaqDNA聚合酶(5U/μL)            0.4μL

ddH₂O                           34.6μI

(2)PCR反应条件：反应在PCR仪上进行，95℃预变性2min，然后按下列参数进行40次循环反应：

变性95℃                        15s

退火55℃                        30s

延伸72℃                        45s

循环结束后72℃补偿延伸10min，反应产物保存在4℃。

实验结果显示(图1)，仅苹果蠹蛾在289bp处有明亮条带，其余三种食心虫在该位置均无条带，说明苹果蠹蛾特异引物对苹果蠹蛾是特异的，从而从实验上证明了该引物的特异性及对苹果蠹蛾的目的片段具有良好的扩增效果。

综上所述，本发明利用苹果蠹蛾与其它三种食心虫的序列差异，设计出针对苹果蠹蛾的特异引物，并以此引物为核心，开发出一种利用该引物进行PCR扩增以快速鉴别苹果蠹蛾的方法。这种方法的优点在于：苹果蠹蛾鉴定引物特异性强，对苹果蠹蛾的目的片段具有良好的扩增效果，保证了鉴定结果的准确性；PCR反应为常规条件，成功率高；实验结果以电泳图形式呈现，仅根据289bp条带的有无，即可对样本进行鉴定，结果清晰明了。

实施例

利用特异性的苹果蠹蛾鉴定引物IF/R对采集自中国不同地区的苹果蠹蛾、桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫标本进行快速鉴定。

引物1F：5′-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3′

引物1R：5′-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3′

步骤1：待鉴定食心虫的总DNA提取

1.标本采集信息：采集来自我国不同地区的10份苹果蠹蛾样本，5份桃小食心虫样本，4份梨小食心虫样本和3份李小食心虫样本。

2.DNA模板的提取

随机挑选单头食心虫标本(纯酒精保存)，幼虫取头部，成虫取足或胸部肌肉；样本取出后浸入无菌水中除去酒精，并在吸水纸上晾干；样本晾干后转移至100μL提取液中充分研磨；将匀浆移至60～70℃水浴15～30min；在匀浆中加入10μL冷的8mol/L NaAc，冰浴15min；离心20min(10000rp/min 4℃)；吸取上清液，在上清液中加入等体积异丙醇，离心15min(10000rp/min)，弃上清；加入70％乙醇1ml洗涤DNA，离心5min(10000rp/min)，弃上清；再加入70％乙醇1ml洗涤DNA，离心5min(10000rp/min)，弃上清；自然晾干后加入50μL无菌水溶解DNA，该DNA溶液可用于PCR扩增。

步骤2：PCR扩增

PCR反应所用引物为本发明提供的特异性苹果蠹蛾鉴定引物IF/R

引物1F：5′-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3′

引物1R：5′-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3′

PCR反应采用50μL标准体系，含有10×Taq buffer(Mg²⁺)5μL，10mmoldNTP 4μL混合液，引物各1μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.4μL，模板DNA溶液4μL，ddH₂O 34.6μL。反应条件为：95℃预变性2min，95℃15s，55℃30s，72℃45s，40个循环后72℃补偿延伸10min。

步骤3：琼脂糖凝胶电泳及紫外检测

琼脂糖凝胶电泳所用的琼脂糖凝胶浓度为1％，含少量EB，总上样量4μL(3μLPCR产物，1μLloading buffer)，电泳电压为120v，时间为30min。

用紫外光检测仪检测电泳结果并拍照，结果如附图1显示，仅苹果蠹蛾扩增出289bp的明亮条带，而桃小食心虫、梨小食心虫和李小食心虫样本则不能扩增出条带。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表1

序列表2