类泛素化活化酶NAE对流感病毒增殖的影响及NEDD8单克隆抗体的制备

摘要

Neddylation修饰是体内一种广泛的翻译后修饰作用，通过 NEDD8类泛素蛋白小分子与底物蛋白的结合而实现这种修饰作用。该修饰作用广泛地参与细胞内的多种调控，如信号转导、DNA损伤、细胞增殖与分化、细胞周期、细胞凋亡、蛋白质转运等过程。最近研究发现，流感病毒蛋白PB2能被Neddylation修饰而导致PB2蛋白的稳定性降低，从而抑制了流感病毒的复制。可见在流感病毒感染过程中，体内的 Neddylation 修饰起到了一种抗病毒作用。本研究通过构建Neddylation通路关键酶——NEDD8活化酶（E1）的Knock down（KD）细胞系，并用流感病毒（PR8）感染，以探究流感病毒在KD细胞系中的增殖情况，为更好地阐述流感病毒与Neddylation通路之间的关系提供了依据。同时我们也制备了类泛素小分子蛋白NEDD8的单克隆抗体，这为今后更深入地研究内源性Neddylation修饰作用打下了良好的基础，为更好的阐述在病毒感染中Neddylation的免疫调控作用提供了实用的生物工具。本论文的主要研究结果如下： 1．流感病毒在Knock down（KD）细胞系中的增殖效率升高 将含有NAE1、UBA3靶序列的shRNA质粒以及Δ8.9、VSVG辅助质粒共转染293T细胞进行慢病毒包装。将包装出来的慢病毒感染A549细胞，感染24h或48h后在培养基中加入嘌呤霉素，筛选出已被慢病毒感染的细胞，经扩大培养获得相应的KD细胞系，分别命名为NAE1-KD、UBA3-KD。用流感病毒（PR8，1MOI）感染获得的KD细胞系以及对应的对照组细胞系，感作2h后，弃上清并用无菌PBS洗去未结合的流感病毒，加入新鲜的培养基。在不同的时间点（6h、12h、24h、30h）收取细胞及细胞上清，每个时间点两个重复。通过Western blot、TCID50检测和实时荧光定量PCR检测发现，在KD细胞系中各个时间点，无论是病毒蛋白（NP、NS1）的表达水平，还是病毒蛋白的mRNA转录水平，或者是成熟病毒粒子滴度（TCID50）都较对照组细胞有明显上升，而且在 NAE1-KD细胞系中，这种上升趋势更加明显。因此，细胞中 E1的表达水平降低之后，能够促进流感病毒的复制。 2．类泛素小分子蛋白NEDD8单克隆抗体的制备 利用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）从 A549 细胞中扩增出类泛素化蛋白编码的NEDD8基因，将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中，测序验证后转化入BL21(DE3)进行异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，表达获得NEDD8蛋白，经纯化后，免疫接种6周龄BALB/c小鼠。细胞融合后，用酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印迹（WB）方法筛选单克隆抗体细胞株。结果成功制备获得3株单克隆抗体，分别命名为：4B7、1G11、1G3。免疫特异性鉴定结果表明：3株单克隆抗体都有良好的WB及ELISA效价。其中所得到的 1G11 株单抗适用于免疫共沉淀试验，可以特异性检测 NEDD8 修饰的Cullin-1底物。通过分段表达，鉴定单抗针对的抗原表位可能在 29RVEE32氨基酸区域，与泛素化蛋白（Ub）无交叉反应。本研究制备的特异性单抗为进一步鉴定NEDDylation修饰底物提供了良好的抗体工具。 综上所述，本研究初步揭示了NEDDylation修饰过程中的活化酶NAE对流感病毒增值的抑制作用，且成功制备了类泛素化蛋白NEDD8的单克隆抗体，为深入研究流感病毒分子致病的免疫调控机制奠定了良好的基础。

目录

声明

第一章 流感病毒先天性免疫及Neddylation通路研究进展

1.1 概述

1.1.1 人类中的季节性、大流行性和人畜共患流感病毒

1.1.2 禽流感对家禽业的影响

1.2 流感病毒与先天性免疫概述

1.2.1 流感病毒进入宿主细胞

1.2.2 流感病毒感染激活细胞内先天性免疫

1.2.3 抗病毒分子参与先天免疫对抗IAV感染

1.2.4 细胞参与先天免疫对抗IAV感染

1.3 NEDD8介导的翻译后修饰

1.3.1 概述

1.3.2 NEDD活化酶（E1）

1.3.3 NEDD8结合酶（E2）

1.3.4 Neddylation底物：Cullins

1.3.5 CRL活性调节

1.4 研究目的和意义

第二章 类泛素化活化酶NAE对流感病毒增殖的影响

2.1 材料

2.1.1 病毒和鸡胚

2.1.2 细胞与细胞培养耗材

2.1.3 质粒

2.1.4 抗体

2.1.5 其它试剂及耗材

2.2 方法

2.2.1 NAE1、UBA3 Knock-down细胞系的构建

2.2.2 PR8流感病毒感染KD细胞系

2.2.3 病毒滴度测定

2.2.4 免疫印迹试验

2.2.5 RNA提取及反转录

2.2.6 实时荧光定量PCR

2.3 结果

2.3.1 NAE1、UBA3-Knock down细胞系的鉴定

2.3.2 Western blot检测流感病毒在KD细胞系中的增殖

2.3.3 细胞上清病毒TCID50测定结果

2.3.4 实时荧光定量PCR检测细胞中流感M1蛋白表达量

2.4 讨论

2.5 小结

第三章 类泛素化蛋白NEDD8单克隆抗体制备

3.1 材料

3.1.1 细胞和实验动物

3.1.2 载体与主要试剂

3.2 方法

3.2.1 NEDD8 PCR扩增

3.2.2 重组原核表达载体及真核表达载体的构建

3.2.3 NEDD8蛋白原核表达及鉴定

3.2.4 小鼠免疫

3.2.5 间接ELISA方法的建立

3.2.6 饲养层细胞的制备

3.2.7 SP2/0细胞与脾细胞融合

3.2.8 杂交瘤细胞的筛选与亚克隆

3.2.9 腹水的制备

3.2.10 单抗效价检测

3.2.11 单克隆抗体亚类鉴定

3.2.12 免疫共沉淀（co-IP）

3.2.13 NEDD8抗原表位鉴定

3.3 结果

3.3.1 原核重组质粒pET30-NEDD8鉴定

3.3.2 重组蛋白的表达和纯化结果

3.3.3 间接ELISA方法建立

3.3.4单抗制备

3.3.5 WB检测

3.3.6 单克隆抗体的ELISA效价检测结果

3.3.7 co-IP检测结果

3.3.8 NEDD8抗原表位鉴定

3.4 讨论

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

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