小分子化合物MLN4924靶向NEDD8活化酶(NAE)抑制非小细胞肺癌增殖的研究

摘要

NEDD8是一种类泛素样蛋白，与泛素化途径相似，在细胞生理过程中主要参与稳定蛋白、调节底物蛋白活性以及转录调节等功能[4，6，7]。研究证实，抑制NEDD8通路将是一个新的抗肿瘤的方法和途径。MLN4924是一种有效的、选择性的NEDD8活化酶的小分子抑制剂，能够与NEDD8活化酶(NAE)结合形成NAE-MLN4924复合物，抑制NEDD8活化酶活性，控制部分依赖于CRL酶的泛素化途径，影响相关蛋白质的降解[13]。研究发现，NAE有望成为研发抗肿瘤药物的新靶点，MLN4924作为NAE的抑制剂具有成为新型抗肿瘤药物的希望。
　　目的:
　　本研究以非小细胞肺癌细胞为研究模型，观察MLN4924对细胞生长的抑制作用，分析MLN4924干预后非小细胞肺癌细胞的增殖活性、周期分布和周期调控蛋白的表达，探讨MLN4924对细胞增殖相关信号通路的调控，明确MLN4924抑制非小细胞肺癌细胞增殖的分子机制。
　　方法:
　　体外培养人非小细胞肺癌H1975细胞，MTT实验分析不同浓度MLN4924作用细胞24、48和72h对其增殖的影响;集落克隆实验分析MLN4924对细胞增殖能力的影响;PI单染法分析细胞周期分布;以及Western blot实验检测周期调控蛋白CDK4、cyclin D1和天然抑制蛋白p21、p27的表达。
　　结果:
　　MLN4924呈剂量-时间依赖抑制非小细胞肺癌细胞的生长，其中H1975细胞对MLN4924较为敏感，不同浓度（5、10、20、40μM）的MLN4924作用48h后，存活率分别为91.3±2.6％、86.0±4.2％、82.4±4.1％、79.8±3.4％，作用72h后，存活率分别为39.3±5.7％、39.7±4.1％、35.9±2.8％、36.9±2.1％。5、10、20和40μMMLN4924作用细胞7d，均显著抑制H1975细胞形成集落克隆。10和40μM MLN4924作用细胞48h，G0/G1期细胞比例显著增加，周期调控蛋白CDK4、cyclin D1表达明显下调，其天然抑制蛋白p21、p27的表达水平显著上调。
　　结论:
　　MLN4924具有抑制非小细胞肺癌细胞增殖的作用效应，其分子机制是通过调控周期相关蛋白的表达，将细胞阻滞于G0/G1期。

目录

声明

致谢

序言

摘要

英文缩略词表

1．引言

2．实验材料

2．1 细胞株与药物

2．2 主要试剂和耗材

2．3 仪器设备

2．4 主要实验试剂的配制

3．实验方法

3．1 NSCLC细胞的常规培养、冻存和复苏

3．2 MTT实验分析MLN4924对NSCLC细胞生长的影响

3．3 集落克隆实验分析MLN4924对细胞增殖能力的影响

3．4 流式细胞术分析MLN4924对细胞周期分布的影响

3．5 Western Blot实验分析MLN4924作用后细胞周期蛋白表达的变化

3．6 数据分析

4．实验结果

4．1 MLN4924对NSCLC细胞生长的影响

4．2 MLN4924对H1975细胞集落克隆形成的影响

4．3 MLN4924对细胞周期分布的影响

4．4 MLN4924对细胞表达周期相关蛋白的影响

5 讨论

6 结论

参考文献

综述 类泛素化修饰Neddylation在肿瘤中的研究进展

作者简历及在学期间所取得的科研成果