玉米肌醇-1-磷酸合成酶基因ZmMIPS的克隆及其抗旱功能鉴定

摘要

玉米（Zea maysL.）是重要的粮食作物之一，干旱胁迫严重影响了玉米产量。相关研究结果表明过表达L-肌醇-1-磷酸合成酶基因（MIPS,L-myo-inositol-1-phosphate synthase）可增强植物对高盐、冷和氧化等环境的耐受性。MIPS是肌醇合成的限速酶，主要负责催化葡萄糖-6-磷酸转变为L-肌醇-1-磷酸，之后再由IMP(myo-inositol monophosphatase)催化生成肌醇。肌醇及其衍生物在生物体的生长发育中发挥着重要的作用。 本研究以玉米自交系B73为实验材料，通过同源比对，克隆得到编码玉米肌醇-1-磷酸合成酶的ZmMIPS基因，并对其功能及表达调控进行研究。主要研究结果如下： 1.在玉米基因组中克隆得到2个MIPS基因，分别命名为ZmMIPS1(GRMZM2G155242)和ZmMIPS2(GRMZM2G004528)。两者编码产物在体外均具有合成L-肌醇-1-磷酸的活力。 2.动力学实验表明ZmMIPS2对G-6-P的Km明显大于ZmMIPS1。ZmMIPS1与ZmMIPS2活性的发挥对NAD+含量的依赖程度不同。 3.ZmMIPS1和ZmMIPS2在多个组织均有表达，且ZmMIPS2在叶及胚中表达量较高。ZmMIPS1和ZmMIPS2在胚发育的前中期表达量较高。此外，ZmMIPS1和ZmMIPS2受热激、渗透（Mannitol）、氧化（MV）和ABA的诱导表达。 4.在玉米叶肉原生质体过表达ZmDREB2A后，内源ZmMIPS的mRNA及蛋白积累量明显上升。构建ZmMIPS启动子驱动Rluc表达以及2×35S启动子驱动Fluc表达的双荧光素酶表达载体，将其分别与GFP或ZmDREB2A的表达载体共转化玉米叶肉原生质体，发现与ZmDREB2A表达载体共转化的原生质体中Rluc活性明显升高。证明ZmDREB2A上调ZmMIPS1和ZmMIPS2的表达。 5.过表达ZmMIPS提高了拟南芥叶片中的肌醇含量和拟南芥的抗旱性。 综上所述，本研究在玉米中共克隆得到2个ZmMIPS基因，这两个基因响应多种非生物胁迫。同时，ZmDREB2A正调控ZmMIPS的表达，过表达ZmMIPS可大幅提升植物的抗旱性。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 综述

1.1植物抗旱性研究进展

1.1.1功能基因与植物抗旱性

1.1.2转录因子与植物抗旱性

1.2肌醇-1-磷酸合成酶（MIPS）的研究进展

1.2.1肌醇-1-磷酸合成酶简介

1.2.2 MIPS与植物生长发育

1.2.3 MIPS与植物抗逆性

1.3肌醇衍生物概况

1.3.1植酸（IP6）

1.3.2磷脂酰肌醇（PtdIns）与1,4,5-肌醇三磷酸（IP3）

1.3.3抗坏血酸（AsA）与IAA-肌醇共轭物

1.4研究目的及意义

第二章 玉米肌醇-1-磷酸合成酶基因（ZmMIPS）的鉴定及其表达蛋白的酶活分析

2.1材料与方法

2.1.1玉米ZmMIPS基因进化树分析

2.1.2玉米B73幼苗培育及叶片cDNA获得

2.1.3 ZmMIPS的原核表达

2.1.4 ZmMIPS-His6抗体制备

2.1.5 ZmMIPS-His6蛋白活性鉴定

2.1.6 ZmMIPS蛋白三维结构及配体结合位点分析

2.2结果与分析

2.2.1玉米ZmMIPS候选基因的克隆及分析

2.2.2 ZmMIPS酶活力鉴定及分析

2.2.3 ZmMIPS蛋白三维结构及配体结合位点预测

第三章 玉米ZmMIPS的表达模式及抗旱功能研究

3.1材料与方法

3.1.1样品的准备与采集

3.1.2 RNA的提取及反转录

3.1.3 ZmMIPS1与ZmMIPS2表达量鉴定

3.1.4 ZmMIPS的亚细胞定位

3.1.5 ZmDREB2A正调控ZmMIPS的表达

3.1.6过表达ZmMIPS拟南芥的获得

3.1.7过表达ZmMIPS拟南芥株系表达量鉴定

3.1.8干旱处理

3.2结果与分析

3.2.1 ZmMIPS的时空表达模式

3.2.2 ZmMIPS逆境响应表达谱

3.2.3 ZmMIPS的亚细胞定位

3.2.4 ZmDREB2A正调控ZmMIPS的表达

3.2.5 ZmMIPS过表达拟南芥表达量鉴定

3.2.6 ZmMIPS过表达拟南芥抗旱性分析

第四章 讨论

4.1 ZmMIPS1和ZmMIPS2的进化关系分析

4.2过表达ZmMIPS可提高植物抗旱性

4.3本研究创新点

4.4后续研究计划

参考文献

附录

致谢

个人简历