苦荞类黄酮糖基转移酶的重组表达与酶学性质研究

摘要

黄酮类化合物是具有2-苯基色原酮结构的一类植物次生代谢物，它常以糖苷的形式存在于植物体内，参与着诸多生命活动。尿苷二磷酸依赖性糖基转移酶（UDP-glycosyltransferase，UGT）介导着黄酮类化合物的糖基化修饰过程，它能够将多种糖基（如葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，阿拉伯糖等）从UDP-糖基供体转移到类黄酮糖苷配基上，改变黄酮类化合物的稳定性、可溶性及生物活性，参与植物的生长发育，次生代谢物累积及胁迫响应等过程。本研究拟克隆苦荞类黄酮糖基转移酶(UDP-glycose:flavonoid glycosyltransferase,UFGT）FtUFGT1，FtUFGT5，FtUFGT6，FtUFGT7基因，构建各FtUFGT的重组表达和纯化体系，并分析FtUFGT的酶学性质，以期为其体外催化黄酮类衍生物的合成奠定基础；此外，研究拟通过重组表达苦荞UDP-鼠李糖合酶（UDP-rhamnose synthase,RHM）解决糖基转移酶活性测定底物UDP-鼠李糖缺乏的问题；基于pCAMBIA3301-eGFP植物表达载体，实现苦荞类黄酮糖基转移酶在SR-1烟草(Nicotiana tabacum cv.Petit Havana SR-1)中的过表达，以期为深入研究FtUFGT对苦荞次生产物积累的调控及催化底物奠定材料基础。研究主要获得如下研究结果： （1）从本地苦荞转录组数据库筛选出4个苦荞类黄酮糖基转移酶基因FtUFGT1，FtUFGT5，FtUFGT6，FtUFGT7。多序列比对显示，所选FtUFGT与来自其他物种的UFGT一致性较高，预测FtUFGT1与为类黄酮O-糖基转移酶，FtUFGT6为UDP-鼠李糖:类黄酮3-O-葡萄糖苷(1→6)鼠李糖基转移酶，FtUFGT7为类黄酮C-糖基转移酶。通过qRT-PCR分析了4个FtUFGT基因在苦荞各组织中的表达水平，结果表明，四种FtUFGT基因在苦荞各组织的表达模式差异明显，FtUFGT1，FtUFGT7在花中有最高表达量；FtUFGT5和FtUFGT6在种子中表达水平最高。4个基因在茎中表达水平均最低，预示四种酶在次生代谢途径中行使着不同的功能。 （2）通过RT-PCR克隆目的基因，经无缝克隆构建了pGEX-6p-1-FtUFGT1，pGEX-6p-1-FtUFGT5，pGEX-6p-1-FtUFGT6，pGEX-6p-1-FtUFGT7表达载体，实现了4种目的蛋白在大肠杆菌Rosetta（DE3）中的可溶性表达，并通过GST亲和层析纯化得到高纯度目的蛋白。以槲皮素为底物，采用薄层色谱法及高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法分析了重组FtUFGT1的酶学性质。结果表明FtUFGT1具有黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶活性，能够以UDP-葡萄糖（UDPG）和槲皮素为底物合成异槲皮素。FtUFGT1在30℃，pH7.0条件下可发挥最高活性，实现槲皮素向异槲皮素的高效转化，比活力为9.174U/mg。含有1μmol/L FtUFGT1的反应体系中，槲皮素和UDPG的浓度分别在1.526×103~2.287×103μmol/L和5.084×104~16.980×104μmol/L范围内时，酶活性与底物浓度呈良好线性关系。FtUFGT1的三突变体F21Y_F23Y_F127Y丧失了对槲皮素的糖基化活性。 （3）构建苦荞UDP-鼠李糖合酶FtRHM的原核表达载体pMAL-c4x-FtRHM，实现了其在大肠杆菌中的可溶性表达，通过Amylose-Sepharose亲和柱纯化获得了目标蛋白。以UDPG为底物未检测到FtRHM的UDP-鼠李糖合成活性。 （4）构建了四种FtUFGT的pCAMBIA3301-eGFP植物表达载体，通过农杆菌介导的叶盘法侵染SR-1型烟草。通过Basta抗性筛选和PCR检测共获得77株过表达FtUFGT1烟草，36株过表达FtUFGT6烟草及2株过表达FtUFGT7烟草。分光光度法测定过表达FtUFGT1的T0代烟草中总黄酮含量显示，各株系总黄酮含量差异无明显规律。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 引言

1.1 苦荞简介

1.2 黄酮类化合物研究进展

1.2.1 黄酮类化合物的代谢

1.2.2 黄酮类化合物的生物功能

1.2.3 黄酮类化合物的检测方法

1.3 糖基化修饰与糖基转移酶

1.3.1 植物次生代谢产物的糖基化修饰

1.3.2 糖基转移酶的结构特征

1.3.3 次生代谢相关糖基转移酶功能分析

1.4 研究目的与意义

第二章 苦荞类黄酮糖基转移酶的生物信息学分析

2.1实验材料

2.2 FtUFGT序列的生物信息学分析

2.3实验结果

2.3.1 FtUFGT1氨基酸序列比对

2.3.2 FtUFGT5氨基酸序列比对

2.3.3 FtUFGT6氨基酸序列比对

2.3.4 FtUFGT7氨基酸序列比对

2.4 讨论

第三章 FtUFGT基因的克隆与组织表达分析

3.1 实验材料

3.1.1植物材料与菌株

3.1.2 酶与试剂

3.1.2 溶液

3.1.3 仪器

3.2 实验方法

3.2.1 苦荞RNA提取

3.2.2 反转录

3.2.3 引物设计

3.2.4 目的基因扩增

3.2.5 pGEX-6p-1-FtUFGT表达载体构建

3.2.6大肠杆菌感受态细胞的转化

3.2.7菌落鉴定

3.2.8质粒PCR

3.2.9定量引物设计

3.2.10 qRT-PCR

3.3 结果与分析

3.3.1 FtUFGT基因克隆

3.3.2 pGEX-6p-1-FtUFGT重组表达载体构建

3.3.3苦荞中UFGT基因组织表达分析

3.4 讨论

第四章 FtUFGT蛋白的重组表达与纯化

4.1.1 菌株

4.1.2 酶与试剂

4.1.3 溶液

4.1.4 仪器

4.2 实验方法

4.2.1 pGEX-6p-1-FtUFGT转化大肠杆菌

4.2.2 目的蛋白的诱导表达

4.2.3蛋白可溶性分析

4.2.4 FtUFGT蛋白的GST亲和层析

4.3.1 FtUFGT蛋白表达分析与可溶性分析

4.3.2 FtUFGT蛋白纯化

4.4 讨论

第五章 FtUFGT1酶学性质分析

5.1.1 酶与试剂

5.1.2 溶液

5.1.3 仪器

5.2 实验方法

5.2.1 FtUFGT1活性分析

5.2.2薄层层析硅胶板制备

5.2.3 FtUFGT1催化产物的薄层层析鉴定

5.2.4 FtUFGT1催化产物的HPLC鉴定

5.2.5 绘制异槲皮素标准曲线

5.2.6 FtUFGT1的酶学性质分析

5.2.6 FtUFGT1突变体的构建

5.2.6 FtUFGT1突变体的活性分析

5.3 结果与分析

5.3.1 FtUFGT1催化产物的鉴定

5.3.2异槲皮素标准曲线

5.3.3 最佳反应时间

5.3.4 底物浓度对FtUFGT1活性的影响

5.3.5 不同温度对FtUFGT1的活性影响

5.3.6 不同pH值对FtUFGT1的活性影响

5.3.7 不同浓度甲醇对FtUFGT1活性的影响

5.3.8Triton X-100对FtUFGT1活性的影响

5.3.9 FtUFGT1突变体的活性分析

5.4 讨论

第六章 FtUFGT基因植物表达载体的构建及烟草转化

6.1 实验材料

6.1.1 烟草植株与菌株

6.1.2 酶与试剂

6.1.3 溶液

6.1.4 仪器

6.2 实验方法

6.2.1 FtUFGT过表达片段扩增

6.2.2 pCAMBIA3301-eGFP载体酶切

6.2.3 CAMBIA3301-FtUFGT-eGFP重组载体的构建及转化

6.2.4 阳性鉴定

6.2.5 农杆菌转化

6.2.6 叶盘法转化烟草

6.2.7 烟草基因组提取

6.2.8 阳性植株筛选

6.2.9 转基因烟草的总黄酮测定

6.3 结果与分析

6.3.1 pCAMBIA3301-FtUFGT-eGFP植物表达载体构建

6.3.2 SR-1烟草转化

6.3.3 阳性转基因烟草筛选

6.3.4 T0代FtUFGT1过表达烟草的总黄酮测定

6.4 讨论

第七章 苦荞鼠李糖合酶的表达与纯化

7.1.1植物材料与菌株

7.1.2 酶与试剂

7.1.2 溶液

7.1.3 仪器

7.2 实验方法

7.2.1 FtRHM基因的生物信息学分析

7.2.2 FtRHM基因扩增

7.2.3 pMAL-c4x-FtRHM表达载体构建与大肠杆菌转化

7.2.4 FtRHM蛋白的表达分析

7.2.5 FtRHM蛋白的亲和层析

7.2.6 RHM的活性分析

7.3结果与分析

7.3.1 FtRHM的生物信息学分析

7.3.2 FtRHM基因克隆与pMAL-c4x-FtRHM表达载体构建

7.3.3 FtRHM蛋白的表达与纯化

7.3.4 FtRHM活性分析

7.4 讨论

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 展望

参考文献

附录

致谢

个人简历