斑马鱼心脏毒性评价模型的建立及美托洛尔心脏毒性作用机制研究

摘要

药物从设计到上市的整个研究阶段,毒性反应是导致药物研发失败的最主要原因。即使上市后仍有许多药物由于出现研发阶段未能发现的毒性反应而被撤市或严格限制使用。药物的心血管毒性占药物全部毒性反应的26％。伴随着组合化学、基因组学等学科的迅猛发展,每年新增大量的化合物进入新药研发领域,必然要求在临床前研究阶段对其心血管毒性进行灵敏、快速、准确及实用的高通量筛选与评价,及早发现心血管毒性,提高新药研发的成功率。目前,用于药物毒性评价的模型有两大类:一类是以细胞、组织为代表的体外评价模型,虽适合高通量毒性筛选,但不能反映动物的新陈代谢和整体生理过程。另一类是以啮齿类为代表的哺乳动物体内评价模型,可从整体水平直观地反映药物的毒性作用,但不适合新药研发早期药物毒性的高通量筛选。由于以上两类方法具有各自的局限性,越来越多的研究人员使用斑马鱼进行药物毒性的筛选和安全性评价。斑马鱼是一种脊椎模式动物,具有个体小、产卵多、体外受精与发育、发育快、胚胎透明、易于观察、饲养简便等优点。斑马鱼在生理过程、毒性反应方面和人类非常相似。目前,斑马鱼已被欧洲替代法验证中心(ECVAM)推荐为新的替代动物,成为仅次于小鼠的第二优先脊椎模式动物。
　　美托洛尔属于第二代选择性β1受体阻断剂,临床广泛用于治疗高血压、心律失常、心力衰竭等心血管疾病。同时,美托洛尔也具有引起心力衰竭加重、心率过缓等心血管毒性反应。
　　本研究依据斑马鱼的生理结构优势,以其为模式动物,从心血管系统结构和功能两方面对已知心血管毒性阳性化合物进行安全性评价,探讨斑马鱼模型被用于药物心血管毒性筛选和安全性评价的可靠性。并将斑马鱼心血管毒性评价模型用于美托洛尔心血管毒性机制研究。
　　本研究选择斑马鱼胚胎为试验动物,以已知心脏毒性阳性药物阿霉素、布洛芬、5-氟脲嘧啶、利多卡因为受试药物,通过对斑马鱼心血管系统形态学观察、静脉窦-动脉球(SV-BA)距离测量、心率测量评价四种药物的心脏毒性作用特征,对斑马鱼心血管毒性评价模型的有效性进行验证。实验结果表明,4种心血管毒性阳性药物作用48h后,斑马鱼心血管系统出现不同程度的心包水肿、卵黄囊水肿、出血等形态学改变;斑马鱼心脏发育过程受到影响,造成心脏环化不全,SV-BA距离延长;斑马鱼心脏功能受损,出现心率降低,随着浓度增加心率逐渐降低,呈现明显剂量反应关系。
　　美托洛尔作用24h,可引起斑马鱼胚胎死亡。各实验组斑马鱼胚胎死亡数目随着美托洛尔浓度升高而不断增加,具有明显剂量依赖性。经计算美托洛尔24hLC50为8.1g/L,95%可信区间为6.7～9.7g/L。本研究对美托洛尔的心脏毒性作用机制进行了初步探索。以6hpf斑马鱼胚胎为模型,以斑马鱼心血管系统形态学改变、SV-BA间距和心率为毒性终点,通过显微镜下形态观察、测量SV-BA距离和DVC摄像系统测量心率,评价美托洛尔的心血管毒性效应特征。实验结果显示,美托洛尔引起斑马鱼心包水肿、卵黄囊水肿、出血等心血管系统形态学改变;影响斑马鱼心脏发育,破坏环化过程,致使心室和心房空间位置改变,导致SV-BA距离延长,心脏出现线性化。美托洛尔还损害斑马鱼心脏正常生理功能,造成心率降低。通过组织切片和HE染色方法研究美托洛尔暴露后斑马鱼心脏缩小是否由于心脏心肌组织减少所造成。本实验结果证实,斑马鱼心肌细胞和心肌层减少是导致斑马鱼心脏缩小的主要原因。文献报道心肌细胞凋亡是进行性心力衰竭的主要原因。为了研究美托洛尔是否引起斑马鱼心肌细胞凋亡,本研究运用吖啶橙荧光活体染料对斑马鱼心肌细胞凋亡进行初步检测。荧光显微镜下,美托洛尔处理组斑马鱼心脏出现致密亮点,提示美托洛尔可诱导斑马鱼心肌细胞凋亡。为进一步研究心肌细胞凋亡,使用TUNEL法对斑马鱼心肌凋亡细胞进行量化评价。实验结果显示,美托洛尔处理组心肌细胞凋亡率明显高于对照组。充分说明美托洛尔可诱导斑马鱼心肌细胞凋亡。文献揭示β肾上腺素能受体阻断剂可通过阻断β1肾上腺素能受体抑制心肌细胞凋亡,而通过阻断β2肾上腺素能受体促进心肌细胞凋亡。为深入研究美托洛尔诱导斑马心肌细胞凋亡的机制,本研究提取斑马鱼胚胎总RNA,进行逆转录和PCR扩增。电泳结果显示,斑马鱼同时具有β1和β2肾上腺素能受体。Bcl-2家族基因在细胞凋亡的调节中起着非常重要的作用。斑马鱼Bcl-2基因家族、caspase基因家族和人相应基因具有高度同源性。应用半定量PCR方法检测斑马鱼中凋亡调节因子zfBcl-2、zfBax-a和zfcaspase-3、zfcaspase-9基因表达的情况。实验结果表明,美托洛尔诱导斑马鱼zfBcl-2基因表达水平上调,同时上调zfBax-a基因表达,但是zfBax-a基因比zfBcl-2基因的表达量高。因此,zfBcl-2/zfBax-a比值逐渐下降。说明美托洛尔诱导斑马鱼心肌细胞凋亡是通过调节zfBcl-2家族基因表达启动细胞凋亡信号。Caspase酶系作为细胞凋亡的中枢效应器,在细胞凋亡的启动和过程中发挥着极为重要的作用。半定量PCR结果显示,美托洛尔可引起斑马鱼zfcaspase-3和zfcaspase-9基因的表达水平升高。蛋白印迹试验进一步证实美托洛尔可上调斑马鱼细胞凋亡蛋白酶zfcaspase-3表达。上述实验结果充分表明美托洛尔诱导细胞凋亡与caspase级联激活密切相关。
　　本研究成功建立了药物心血管毒性高通量筛选和安全性评价斑马鱼模型。通过斑马鱼模型研究美托洛尔对心血管系统的毒性作用,探讨了其可能机制。结果表明,美托洛尔引起心脏毒性的作用机制是通过影响zfBcl-2和zfBax-a的表达启动细胞凋亡程序,通过caspase级联激活诱导斑马鱼心肌细胞凋亡,这可能是通过阻断β2受体实现的。本研究的结果为深入研究β受体阻断剂心血管毒性作用机制和新药研制提供理论依据。

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前言

1. 斑马鱼在毒理学研究中的应用

2.β1肾上腺素能受体阻断剂-美托洛尔临床使用现状

第一部分 斑马鱼心脏毒性评价模型的建立

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

第二部分 美托洛尔心脏毒性作用机制研究

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

4 小结

全文总结

全文创新点

综述

斑马鱼非常适合进行药物安全性评价的优势：

斑马鱼发育毒性研究

斑马鱼心血管毒性研究

斑马鱼神经毒性研究

展望

参考文献

发表论文

1 材料与方法

2 结果

3. 讨论

致谢

参考文献

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