人脂联素基因的重叠延伸PCR法克隆及其在毕赤酵母中的诱导表达

摘要

本研究利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素(ADPN)基因cDNA序列，构建了其克隆载体pGEM-T-ADPN。通过测序对其进行序列分析后，进一步构建其毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN，然后利用电击法转化毕赤酵母GSll 5，经甲醇诱导重组酵母表达，并对表达产物进行分析和研究，取得了如下进展： 利用重叠延伸PCR法从人血液中扩增出人脂联素基因第二外显子和第三外显子编码序列，并准确拼接，构建了克隆载体pGEM-T-ADPN。通过PCR和酶切初步鉴定正确后，对其进行测序，测序结果和NCBI中登陆号为NM 004797.2的人脂联素cDNA序列比对，结果完全一致，同源性为100％。表明人脂联素基因已经成功克隆并连接至克隆载体pGEM-T中。 设计分别带有BamH I和EcoR I两个酶切位点的人脂联素基因引物，以pGEM-T-ADPN为模板，扩增出5'端和3'端分别带有BamH I和EcoRI两酶切位点的ADPN基因，然后用这两种酶切后连接至毕赤酵母表达载体pPIC3.5K中。重组表达载体pPIC3.5K-ADPN转化大肠杆菌DH5tx并利用其上携带的氨苄青霉素抗性基因筛选出抗性菌株，然后做PCR及双酶切鉴定。经鉴定人脂联素基因已经准确地连接到毕赤酵母表达载体pPIC3.5K中。 用电转化法将重组酵母表达载体pPIC3.5K.ADPN导入甲醇型酵母(Ppastoris)菌株GSll5中，获得转化子。将转化子采用营养缺陷、遗传霉素、PCR、Soutern杂交筛选后，得到多株重组酵母菌株。在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养，对重组酵母菌株进行了诱导表达。经SDS.PAGE和Western杂交检测人脂联素蛋白表达情况，结果表明：经1％甲醇诱导后，在28 kDa处有目的蛋自条带出现，且甲醇诱导48 h后目的蛋白表达量最高。说明Ppastoris成功表达了人脂联素蛋白且表达的蛋白具有抗原性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分前言

1.1脂联素的结构和生化特性

1.1.1脂联素的发现

1.1.2脂联素的基因结构

1.1.3脂联素的蛋白结构

1.1.4脂联素的生化特性

1.2脂联素的血浆浓度及其合成及分泌的影响因素

1.2.1血浆浓度

1.2.2影响因素

1.3脂联素的分子受体

1.3.1脂联素受体的结构

1.3.2脂联素受体的表达调控

1.4脂联素的信号转导

1.4.1 PPARα信号转导通路

1.4.2 AMPK信号转导通路

1.5脂联素的生物学作用

1.5.1脂联素对脂肪和糖类代谢的影响

1.5.2脂联素对高血压和肥胖的作用

1.5.3脂联素对胰岛素抵抗的影响

1.5.4脂联素对血管内皮分泌功能的影响

1.5.5脂联素的抗炎及抗动脉粥样硬化作用

1.5.6脂联素在非酒精性脂肪肝和肾脏病变中的作用

1.5.7脂联素在肾脏病变中的作用

1.6巴斯德毕赤酵母表达系统

1.6.1巴斯德毕赤酵母表达系统生产外源蛋白研究进展

1.6.2巴斯德毕赤酵母表达系统的优势

1.7该研究的目的、意义和内容

1.7.1研究的目的和意义

1.7.2研究内容

第二部分材料和方法

2.1实验材料

2.1.1血液

2.1.2菌株与质粒

2.1.3主要生化试剂

2.1.4主要仪器

2.1.5培养基及实验试剂配制

2.2实验方法

2.2.1人血液中提取人基因组DNA

2.2.2重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因编码序列

2.2.3克隆载体p GEM-T-ADPN构建及检测

2.2.4酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN的构建及检测

2.2.5酵母表达载体的线性化和纯化

2.2.6毕赤酵母感受态细胞的制备和电击转化

2.2.7毕赤酵母转化子基因组的提取

2.2.8酵母转化子的PCR鉴定

2.2.9重组子的Southern杂交鉴定

2.2.10人脂联素基因的诱导表达和Western杂交检测

第三部分实验结果

3.1人脂联素基因cDNA序列的克隆

3.1.1人血液中提取人基因组总DNA

3.1.2人脂联素基因两外显子的获得

3.1.3重叠延伸PCR法拼接人脂联素基因cDNA序列

3.2克隆载体pGEM-T-ADPN的检测

3.2.1 pGEM-T-ADPN的PCR检测

3.2.2 pGEM-T-ADPN的双酶切检测

3.3目的基因的测序及其翻译序列分析

3.3.1目的基因的测序结果

3.3.2目的基因翻译序列分析

3.4酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN的鉴定

3.4.1酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN的构建流程

3.4.2 pPIC3.5K-ADPN的PCR和双酶切鉴定

3.5酵母转化子的筛选及鉴定

3.5.1营养缺陷型筛选和G418抗生素筛选

3.5.2酵母转化子的PCR鉴定

3.5.3重组酵母基因组southern杂交鉴定结果

3.6目的蛋白的诱导表达分析

3.6.1重组酵母诱导表达及其SDS-PAGE分析

3.6.2人脂联素的诱导表达和Western杂交鉴定

第四部分讨论

4.1重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因cDNA序列

4.2毕赤酵母重组子的筛选

4.3关于western杂交的内参蛋白

4.4人脂联素的表达效率

第五部分小结

参考文献

致 谢