改进重叠延伸PCR法构建高山被孢霉重组载体

摘要

高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种油脂真菌，腐生真菌，由于可以积累种类多样的多不饱和脂肪酸（PUFAs）且主要积累花生四烯酸(ARA)而广受关注。不仅可以作为研究脂质合成路径的模式生物，还被用来工业生产ARA。ω3去饱和酶可以催化n-6途径的PUFAs生成n-3途径的PUFAs，具有非常重要的作用。本文主要通过构建表达载体，试图建立起可以进行M.alpina基因敲除的转化系统。通过同源重组的方法敲除ω3基因，使得M.alpina富集更多的ARA。
　　 苹果酸酶(malic enzyme，ME)可以催化苹果酸脱羧基形成丙酮酸，同时利用NADP+产生NADPH，可以为PUFAs去饱和提供还原力，其他的途径产生的NADPH不为脂质的合成提供还原力。在M.alpina中目前已发现A-G7种异构体，其中D和E异构体的活性与脂质积累有关，且两个异构体可能来源于同一个编码基因。通过对扩增的MEcDNA序列比对分析发现，其mRNA序列与前人研究相比，在序列前段多出了一个内含子，这可能是由于采用了不同的剪切方式。本实验扩增到的cDNA,可能编码D异构体。
　　 重叠延伸PCR是一种强大的技术，可以进行DNA片段拼接，把若干来源相同的或者不同的片段拼接成一条长的DNA片段而不需要限制性内切酶;还可以进行DNA定点突变，在目的DNA分子中引入特定的核酸序列;也可以基于PCR方法精确合成全新的长DNA片段。这种方法可以用来进行启动子和编码基因的表达和功能研究等。在本文中，我们对此方法进行了改进，即增加重叠区的引物长度，如ω3aR(1)、CBXBF和MECF等，而两侧的引物序列长度较小，如ω3aF、ω3bR和H4.1F等。并针对第二轮PCR过程中的每个单一循环采用逐次降低退火温度的方法，如扩增HCT片段采用的退火温度为:65℃(1 s)、60℃(1 s)、56℃(1 s)和50℃(30 s)。使用此种方法拼接出ω3(2)、HCT和HMT三条长片段。这种方法可以有效减少非特异性扩增，提高灵敏度，我们把这种方法称之为逐次退火重叠延伸PCR。
　　 载体的构建:载体中使用的启动子和终止子来源于质粒pD4，由于连接片段较多，采用了先把部分小片段拼接成大的片段，然后再连接片段的方法构建。将拼接的片段ω3(2)、HCT和HMT分别连接到pEasy-Blunt Simple克隆载体上，酶切之后依次连接到载体pB2上。由于ME序列(2kb)具有polyT结构，没有连接到载体上。本实验构建出的载体pB2O3CB可以用来敲除ω3基因。

目录

声明

论文说明

摘要

1 前言

1．1 多不饱和脂肪酸研究概述

1．1．1 多不饱和脂肪酸定义

1．1．2 重要的多不饱和脂肪酸及其生理作用

1．1．3 多不饱和脂肪酸的来源及应用

1．2 高山被孢霉的研究概述

1．2．1 高山被孢霉分类及其鉴定

1．2．2 高山被孢霉脂质生产情况

1．2．3 高山被孢霉中一些重要的酶类

1．2．4 高山被孢霉的重要突变体

1．3 真菌基因工程改造方法概述

1．3．1 真菌改造方法

1．3．2 农杆菌介导的转化方法

1．3．3 同源重组敲除基因

1．3．4 高山被孢霉基因工程改造体系

1．4 使用PCR方法概述

1．4．1 重叠延伸PCR研究概述

1．4．2 侧翼片段的克隆

1．5 立题依据

1．5．1 高山被孢霉基因改造的立题依据

1．5．2、重叠延伸PCR改良的立题依据

2 材料和方法

2．1 材料

2．1．1 实验标本

2．1．2 试剂

2．1．3 仪器

2．1．4 常用软件

2．2 方法

2．2．1 高山被孢霉DNA的提取

2．2．2 高山被孢霉RNA的提取及反转录

2．2．3 所需用的PCR反应

2．2．4 DNA纯化、克隆以及载体构建

3 结果与分析

3．1 高山被孢霉抗性浓度的筛选

3．2 目的基因的克隆

3．2．1 基因中间片段的克隆

3．2．2 基因侧翼序列的扩增

3．2．3 ME基因与sdhB基因cDNA的扩增

3．2．4 sdhB基因的突变

3．3 重叠延伸PCR拼接序列

3．4 载体构建

4 讨论

4．1 ME基因讨论

4．2 改良的重叠延伸PCR

4．3 载体的构建

5 结论

参考文献

附录

致谢

发表论文情况