利用重叠延伸PCR技术在酿酒酵母中构建木糖代谢相关基因

摘要

可再生的纤维素物质是生产燃料乙醇的重要潜在原料，而纤维素乙醇开发过程中的一个关键技术就是五、六碳糖的同时利用。目前工业上广泛用来发酵生产乙醇的酿酒酵母只能利用六碳糖而不能利用五碳糖。本实验室已经驯化出一株可以耐受高浓度乙醇的工业酵母，为了在该酵母的单倍体中引入五碳糖的代谢途径，本文运用遗传工程的手段，从树干毕赤酵母和粗糙脉胞菌中分别克隆到木糖代谢相关的基因，置于酿酒酵母内源强启动子的调控下，并通过一步转化法转化酵母细胞，以期能够最终实现酿酒酵母对五、六碳糖的利用。现阶段获得的主要结果如下：
　　 (1)提取酿酒酵母、毕赤酵母、粗糙脉胞菌的基因组，并通过PCR技术分别在48.5℃、46.4℃、54.4℃、50.7℃、61.6℃的退火温度下，克隆并测序了5个目标基因：酿酒酵母磷酸甘油启动子PGK、毕赤酵母木糖还原酶基因xyll、毕赤酵母木酮糖脱氢酶基因xyl2、粗糙脉胞菌木糖还原酶基因xyl1、粗糙脉胞菌木酮糖脱氢酶基因xyl2。
　　 (2)优化了重叠延伸PCR方法，并通过该方法实现了PGK启动子与毕赤酵母和粗糙脉胞菌的木糖还原酶基因xyl1、木酮糖脱氢酶基因xyl2的单顺反子连接。
　　 (3)对本实验室驯化得到的可耐受高浓度乙醇的工业酵母进行产孢及单倍体拆分，并通过PCR验证了a/α两种交配型的存在。设计含有5S rRNA同源序列的外引物，通过PCR在连接后的基因外端加上同源重组臂，一步转化法转化上述酵母单倍体，并初步筛选克隆子。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1纤维素乙醇

1.1.1纤维素乙醇概述

1.1.2纤维素乙醇面临的困难和预解决的问题

1.2五、六碳糖的利用

1.2.1五、六碳糖的代谢工程菌

1.2.2五、六碳糖的代谢途径及异源引入

1.2.3木糖和葡萄糖的转运

1.2.4细胞氧化还原的平衡

1.2.5其他相关途径及改造

1.3合成生物学

1.4重叠延伸PCR技术

1.4.1聚合酶链式反应PCR

1.4.2重叠延伸PCR

1.5本课题的研究内容与意义

第二章 木糖代谢相关功能基因的克隆

2.1材料与方法

2.1.1菌种

2.1.2主要试剂与溶液

2.1.3主要实验仪器

2.2实验方法

2.2.1菌种的保存、活化与培养

2.2.2基因组的提取

2.2.3常规PCR及菌落PCR方法

2.2.4核酸电泳、DNA片段、PCR产物的回收

2.2.5酵母单倍体的拆分

2.3结果与讨论

2.3.1酵母、粗糙脉胞菌基因组提取

2.3.2酵母单倍体的拆分及PCR验证

2.3.3酵母、粗糙脉胞菌木糖代谢相关基因的克隆

2.4小结

第三章 重叠延伸PCR方法实现目标基因的连接

3.1材料与方法

3.1.1菌种

3.1.2主要试剂及溶液

3.1.3实验仪器

3.2实验方法

3.2.1菌种活化培养

3.2.2重叠延伸PCR

3.2.3大肠杆菌感受态制备方法

3.2.4大肠杆菌转化方法及TA克隆筛选

3.2.5 TA克隆转化子的验证

3.2.6酵母细胞醋酸锂转化方法

3.2.7其他实验方法参见2.2实验方法

3.3结果与讨论

3.3.1启动子PGK和各个功能基因的连接

3.3.2 TA快速克隆

3.3.3外源基因重组到酵母基因组上的初步探索

3.4小结

第四章 结论和展望

4.1结论

4.2展望

参考文献

发表论文和科研情况说明

致 谢