重组毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件及其酶学性质的研究

摘要

木聚糖是半纤维素的主要成分，是自然界可再生的丰富生物资源。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖，在饲料、食品、纺织、造纸等行业有着广泛的用途，是现代酶学研究的热点之一。本文对重组毕赤酵母YDL2006(Muts)进行了发酵条件的优化、酶学性质的研究。主要研究结果如下： 通过摇瓶发酵对菌株YDL2006的发酵条件进行了初步的研究确定了最佳种龄为16h，接种量为4％，生长pH4.8，诱导pH5.0，甲醇浓度1％，诱导时间96h，酶活最高可达到4500U/mL以上。 对该菌株的50L发酵罐的发酵工艺作进一步的研究，对溶氧、pH、搅拌转速、通气量等发酵参数及补料工艺进行了系统的研究和优化，确定了以下工艺：接种量4％，初始转速300rpm，通气量1.5m3/h，补加50％的葡萄糖3500mL，湿重290g/L左右，通过调节转速、通气量、罐压和葡萄糖的流加速度使DO维持在20％以上，补料过程中用甲醇浓度传感器保持发酵过程的甲醇浓度始终1.0％以下。维持时间110h左右酶活最高，甲醇用量约6000mL，木聚糖酶平均产量达到52700U/mL，湿重310g/L，整个发酵过程160h左右。 本论文还对该菌种产木聚糖酶的酶学性质进行了研究，采用还原糖法(即DNS法)对该木聚糖酶的一些基本性质进行研究。在不同pH的缓冲液中测定该酶的活性，结果表明该酶的最适pH为4.5，在pH3.5-6.0之间具有较好的稳定性，酶活维持在80％以上；在不同温度下测定该木聚糖酶的酶活，发现其最适反应温度为55℃，合适的反应温度为45-60℃，温度低于30℃或高于70℃时酶的相对活力均很低。80℃时相对酶活仅为9.3％；当将酶液在55℃、65℃、75℃下处理不同时间，55℃处理120min后酶活仍高达90％以上，而经65℃、75℃的热处理，酶活下降较快，但65℃经120min.75℃经100min处理后酶活仍有50％左右，耐热稳定性良好；Mg2+.2n2+、Ca2+对本聚糖酶活性有不同程度的促进作用；Cu2+、Na+、Fe3+等对本聚糖酶有一定的抑制作用。TLC、HPLC测定结果显示：木聚糖酶酶解产物主要以木二糖、木四糖等低聚糖为主，面术糖含量很低；该木聚糖酶是相对单一的内切木聚糖酶。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 综述

1.1引言

1.1.1木聚糖(Xylan)

1.1.2木聚糖酶(Xylanase)

1.1.3木聚糖酶的作用机理

1.1.4木聚糖酶的应用

1.2木聚糖酶基因工程菌发酵国内外研究进展

1.2.1木聚糖酶基因的改造

1.2.2巴斯德酵母表达系统

1.3本研究的目的和意义

1.4本研究的主要内容

第二章 摇瓶发酵条件的研究

2.1材料与方法

2.1.1实验材料

2.1.2.菌种保藏

2.1.3培养方法

2.1.4分析方法

2.1.5外源蛋白表达单一实验条件优化

2.1.6正交设计：

2.2实验结果与讨论

2.2.1生长曲线的绘制

2.2.2种龄的影响

2.2.3接种量的影响

2.2.4诱导时间的影响

2.2.5甲醇浓度对酶活的影响

2.2.6PH值的影响

2.2.7正交实验结果

2.2.8优化条件下摇瓶验证结果

第三章 发酵罐发酵工艺的研究

3.1材料与方法

3.1.1实验材料

3.1.2分析方法

3.1.3发酵工艺路线

3.1.4培养方法

3.2实验结果与讨论

3.2.1pH控制工艺

3.2.2溶氧控制工艺

3.2.3温度控制工艺

3.2.4补料工艺的确定

3.2.550L发酵工艺的小结

第四章 重组毕赤酵母产木聚糖酶的酶学性质研究

4.1材料与方法

4.1.2实验材料

4.1.2分析方法

4.1.3酶学性质研究

4.1.4酶解反应及其产物分析

4.2实验结果与讨论

4.2.1酶作用的最适条件

4.2.2酶的稳定性

4.2.3木聚糖酶对不同来源的木聚糖底物的降解作用

总结

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致 谢