ELISA法检测腹泻病人微小隐孢子虫血清IgG抗体的研究

摘要

隐孢子虫(Cryptosporidium)是一种属于顶端复合物门的寄生性原虫，是Tyzzer于1907年首先在实验小鼠胃肠道内发现的(小鼠隐孢子虫)，当前认为隐孢子虫种类有：微小隐孢子虫(C.parvum)，小鼠隐孢子虫(C.muris)，火鸡隐孢子虫(C.meleagridis)，贝利隐孢子虫(C.baileyi)，蛇隐孢子虫(C.serpentis)，鱼隐孢子虫(C.nasorum)等，对人和大多数脊椎动物造成感染的主要是微小隐孢子虫。隐孢子虫引起的隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种全球性的人畜共患寄生虫病，但直到80年代以后才逐渐引起重视。免疫力正常的人感染隐孢子虫后，虽可引起急性腹泻，但常为自限性；免疫力低下、功能缺陷或免疫抑制的患者感染此虫后，则可引起严重胃肠炎并伴有水样腹泻，导致大量体液丢失而危及生命。该病已被确定为引起人腹泻的六大病因之一。在艾滋病(AIDS)患者中感染率高达48％左右，长期的严重腹泻，是艾滋病病人的重要致死因素之一。DuPont等报道小剂量(50％感染剂量ID50为132个卵囊)的微小隐孢子虫卵囊足以引起血清呈阴性的健康自愿受试者感染。由于隐孢子虫卵囊体积微小(直径4-6μm)、分布广泛，常规氯化饮水消毒方法不能将其杀灭，故对人类公共卫生造成很大威胁。国外暴发流行时有报告，多发生于病人或病牛接触后的人群，或幼儿园和托儿所等集体单位。据估计，发生在美国威斯康星州Milwaukee的那次暴发中，超过400，000居民染上了水样腹泻，因此致死100多人，危害非常大。所以，隐孢子虫病的研究是目前各国重点研究的寄生虫病之一。 自从发现隐孢子虫以来，许多研究者一直致力于该病的防治研究，但到目前为止，对该病还没有有效的防治措施，因此对该病的早期诊断以及研究防治该病的疫苗就显得尤为重要。正确的早期诊断能最大限度减少病人的死亡，控制该病的流行蔓延，减少损失。目前，实验室鉴定和检测隐孢子虫的主要方法有消化道粘膜活检法、体外培养法、病原学检查法(各种涂片染色、漂浮法或沉淀法等鉴别卵囊)、免疫学检查法及分子生物学检查法。这些方法中或者给病人带来痛苦(消化道粘膜活检法)，或者费时费力难以控制(体外培养法)，或者敏感性和特异性不高(病原学检查法)，或者需要特殊的仪器设备难以在基层推广应用(分子生物学检查法)。作为免疫学检查法之一的酶联免疫吸附试验(ELISA)，操作简便，不需要特殊仪器设备，易于标准化，经济，特别是应用碱性磷酸酶标记，催化速度高，稳定性高，容易交联，底物稳定，检测本底低，是目前疾病临床诊断最受青睐的检测方法。国内外学者应用ELISA在隐孢子虫诊断应用方面进行了大量的尝试，取得了一定成果。然而，因隐孢子虫与其它原虫一样，抗原成分复杂，真正有诊断意义的抗原成分在整个虫体中占的比例较少，并且隐孢子虫虫体小，获取高纯度的虫体抗原较难等因素影响了检测的敏感性和特异性，限制了其实际应用。因此，解决隐孢子虫特异抗原的问题成为解决隐孢子虫的检测与诊断的关键技术问题。 研究者对微小隐孢子虫各生活期中与致病和免疫有关的蛋白进行了筛选，一致认为表面抗原(CP23、CP15/60、CP15等)以其较强的免疫原性成为免疫诊断、免疫预防及免疫治疗的靶抗原，其中的CP23更是以其在基因序列中的保守性、具有较强的免疫活性等特点从而成为微小隐孢子虫免疫诊断和疫苗研制研究的热点。 本研究在前人工作的基础上，诱导表达含有原核表达质粒pET-30a-23的大肠杆菌BL21(DE3)、纯化重组CP23蛋白；用微小隐孢子虫卵囊全抗原和重组CP23抗原分别包被酶标反应板来检测腹泻病人血清中IgG抗体，以确定隐孢子虫病在人群中的分布情况，为临床诊断提供依据。 研究结果：1.用IPTG诱导表达了重组CP23蛋白，并对其进行了纯化和复性；2.用全抗原-ELISA和rCP23-ELISA分别检测腹泻病人血清和滤纸浸出液来检测抗微小隐孢子虫IgG抗体的阳性率，显示血清和滤纸浸出液的阳性率没有差别(X2值分别为0.0038和0.000052，P均＞0.05)；3.244例腹泻病人血清中抗微小隐孢子虫IgG抗体的阳性率用全抗原-ELISA和rCP23-ELISA检测分别为9.84％和11.48％，二者之间没有差别(X2=0.90，P＞0.05)；4.不同性别腹泻病人检测阳性率(rCP23-ELISA)，男性为12.59％，女性为9.90％，二者之间没有差别(X2=0.42,P＞0.05)；5.学龄前儿童(＜7岁)和其他人群(≥7岁)检测结果(rCP23-ELISA)显示：二者之间有统计学意义(X2=4.20，P＜0.05)，学龄前儿童阳性率明显增高。6.市区和郊区腹泻病人的样本检测(rCP23-ELISA)，结果，二者之间有差别(X2=4.24，P＜0.05)，郊区腹泻病人阳性率高。 结论：本研究通过重组DNA技术，成功表达了微小隐孢子虫CP23抗原，抗原提纯后建立了检测腹泻病人血清中隐孢子虫IgG抗体的ELISA方法。并以卵囊全抗原作对照对结果进行了分析。发现两者之间有很好的一致性，检测结果与国内其他研究相符合，表明这两种方法都可以用于人群中隐孢子虫病血清流行病学调查。但重组CP23抗原ELISA不仅具有很高的敏感性，而且制备简便，纯化后浓度很高，避免了纯化卵囊的复杂程序，因而是一种值得推广的检测方法。

目录

主要符号表

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述陷孢子虫病免疫诊断研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢

研究生导师简介及课题指导小组简介