产异戊二烯大肠杆菌工程菌YJM23发酵工艺优化

摘要

异戊二烯(isoprene)是萜烯家族最简单的单体物质,其聚合物在橡胶、食品、香料、航空燃料、有机杀虫剂、医药等领域有广泛用途。鉴于现行生产异戊二烯的石油资源日益枯竭和高污染等缺点,生物法产异戊二烯受到格外关注。然而植物、微生物在自然条件下生产异戊二烯量极少且收集困难,且受到气候和生长周期影响,采用基因工程手段利用微生物生产异戊二烯有着乐观前景。大肠杆菌以清晰的遗传背景、技术操作简单等优点被选作宿主菌生产异戊二烯。研究大肠杆菌新建工程菌的发酵工艺、优化发酵条件对提高异戊二烯产量及工艺优化有重要意义。
　　本课题对所构建的产异戊二烯工程大肠杆菌进行质粒和双酶切遗传特征的分子鉴定;对发酵产物分离纯化,利用核磁共振技术进行目标产物结构鉴定;建立产物量化分析方法。DNA凝胶电泳结果显示质粒大小和酶切片段大小和理论值一致,工程菌构建成功;核磁共振检测结果显示产物化学结构为异戊二烯;建立了用气象色谱对产物进行量化分析的方法,建立了标准曲线:Y=747.80+38651.65X。
　　发酵初期在摇瓶水平对发酵培养基进行了优化。起始,对重要碳氮源和有机酸进行了筛选,筛选出葡萄糖、牛肉浸膏和柠檬酸为对异戊二烯产量有重要影响的碳氮源和有机酸。接着对培养基各组分进行单因素优化,确定各因素最优范围:牛肉浸膏6g/L-8g/L,葡萄糖15g/L-25g/L,硫酸镁0.2mL/L-0.8mL/L,柠檬酸铁铵0.2g/L-0.4g/L,一水合柠檬酸1.1g/L-3.1g/L,微量元素溶液0.7mL/L-1.1mL/L,三水合磷酸氢二钾5g/L-15g/L;利用8因素2水平的Plackett-Burman实验设计对培养基各组分进行了筛选,确定了牛肉膏、微量元素混合液和磷酸氢二钾为影响异戊二烯产量的关键因素;利用最陡爬坡实验,缩小3种关键因素的最佳响应范围为:牛肉浸膏:6.5g/L-8.5g/L、微量元素混合液:0.047mL/L-0.153mL/L、K2HPO4·3H2O:9.8g/L-13.4g/L;最后采用基于中心组合设计的响应面法构建了三元二次方程;确定了最佳培养基配比:K2HPO4·3H2O,10.9g/L,葡萄糖20g/L,牛肉膏7.7g/L,C6H8O7·H2O6.3g/L,FeC6H5O70.3g/L,MgSO40.5mmol/L,(NH4)2SO41g/L,异戊二烯产量从140.16mg/L提高到935.02mg/L,与出发培养基相比提高了567.11％。
　　对氨水和氢氧化钠调节pH做了考察,确定氨水为最佳初始pH调节剂;对诱导剂IPTG浓度进行了优化,确定了最佳诱导浓度为0.05mmol/L。
　　在5L发酵罐水平过程条件优化,绘制了种子生长曲线,确定了最佳接种时间点为种子培养12h;绘制了发酵罐中的细胞生长曲线,确定了最佳诱导时机:OD600为12;对LB培养基、M9培养基和优化过的M9培养基进行了比较,结果显示优化过的M9培养基最适合用于发酵大肠杆菌产异戊二烯;通过对不同诱导温度和溶氧控制水平的优化确定了30℃诱导和20％溶氧水平最适合工程大肠杆菌发酵产异戊二烯。

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第1章 绪论

1.1 异戊二烯介绍

1.2 重组大肠杆菌发酵工艺优化概述

1.3 发酵工艺优化中的试验设计流程简概述

1.4 研究内容和目的意义

1.5 技术路线

第2章 重组菌株及发酵产物验证和检测方法建立

2.1 引言

2.2 实验材料

2.3 实验方法

2.4 结果与分析

2.5 讨论

第3章 摇瓶水平发酵培养基及条件优化

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4结果与分析

3.5讨论

第4章 5L发酵罐水平发酵条件优化及质粒稳定性分析

4.1引言

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4结果及分析

4.5讨论

第5章 结论与展望

5.1结论

5.2 展望

参考文献

附录A

致谢

在学期间的主要科研成果