大肠杆菌O157：H7鸡卵黄抗体（IgY）的酶标与ELISA检测方法建立

摘要

肠出血性大肠杆菌E．coli O157：H7的传播与流行已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。本课题通过对E．coli O157：H7特征抗原分离提取及鸡体免疫，获得特异性鸡卵黄免疫球蛋白(IgY)；并进一步研究IgY的酶(HRP)标记方法，建立检测E．coli O157：H7的免疫学方法。 E．coli O157：H7的抗原分离与鸡体免疫。菌种经鉴定后，采用热酚水法提取菌体脂多糖(LipopoLyrsaccharide，LPS)，进一步酸解得到O-特异性多糖抗原(O-specific poLysaccharide O-SP)。10.4g湿菌体可获得纯化LPS12.5mg，产率为0.12％(w/w)，LPS样品的内毒素活性为166.67EU/mg，有强凝集活性。以制得的3种物质：LPS、O-SP、E．coliO157：H7菌体抗原(加热灭活法制备)作为免疫原，分别免疫产蛋鸡，收集免疫后的高免鸡蛋。 特异性IgY的制备与特性研究。对以上3种免疫原产生的高免鸡卵黄，采用水稀释法，经过膜过滤、盐析、DEAE-Sephadex A-50离子交换色谱等步骤，得到纯化IgY样品(anti-LPS IgY、anti-O-SP IgY、anti-OH IgY)，其纯度为79.6～85.3％，ELISA效价1：800 ～1：1600(稀释起始浓度均为100μg/ml)，抗体提取率74％～77％。采用剂量——反应曲线法测得3种IgY的抗体亲和力排序为：anti-OH IgY>anti-LPS IgY>anti-O-SP IgY；通过交叉反应实验得到3种抗体特异性排序为：anti-O-SP IgY>anti-LPS IgY>anti-OH IgY。 IgY的酶标记工艺研究。选用HRP(辣根过氧化物酶)以不同方法标记抗E．coli O157：H7特异性抗体anti-O-SP IgY；其中过碘酸钠氧化法较戊二醛二步法的酶结合率、标记率高，克分子比值合适，而且酶标抗体的酶活性与免疫反应性均高出后者，所以过碘酸钠氧化法是HRP更可取的IgY标记方法；而在过碘酸钠氧化法中当反应体系中HRP与IgY的分子个数比为3：1时，标记效果最好(克分子比值1.25，结合率37.6％，标记率43.5％)，所制得的酶标抗体的效价也最高(1：640，酶标抗体起始浓度1mg/mL)。双抗夹心ELISA检测方法的建立。确定了包被抗体最佳浓度(anti-LPSIgY 1：80)、酶标抗体最佳工作浓度(anti-O-SP IgY-HRP 1：160)、酶标板的处理程序(40W紫外灯管距离微量板lOcm，照射20min)、封闭液及封闭时间(1％BSA．的PBST，封闭3h)、酶标杭体稀释液及酶标杭体作用时间(PBST-1％BSA-4％PEG6000，作用时间为60min)、底物最佳反应时间(25min，37℃)等对夹心ELISA检测效果有重要影响的实验因素，完成了检测Ecoli O157：H7双抗体夹心ELISA方法的优化。经交叉反应实验、敏感性实验、重复性实验证明本课题建立的夹心ELISA最低检出量为10<'4>CFU/mL，且特异性高(与单克隆抗体组成的夹心ELISA特异性相近)，重复性好(变异系数(CV)小于10％)。 本课题从Ecoli O157：H7鉴定培养与不同抗原的分离制备开始，完成了特异性IgY的制备、特性分析及酶标方法的研究，建立了双抗体夹心ELISA检测方法，为E．coli O157：H7的食品检测和爆发调查提供了有效的技术手段。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号说明

声明

1文献综述

1.1大肠杆菌O157:H7

1.1.1大肠杆菌O157:H7的流行及危害

1.1.2大肠杆菌O157:H7的生物学特性

1.1.3脂多糖结构功能及其抗原制备

1.1.4大肠杆菌O157:H7检测

1.2酶联免疫吸附法(ELISA)

1.2.1 ELISA的检测原理

1.2.2 ELISA的分类及特点

1.2.3抗体的酶标记

1.3鸡卵黄抗体(IgY)

1.3.1 IgY的结构

1.3.2 IgY的性质

1.4本章小结

1.4.1课题主要研究内容

1.4.2研究总体设计思路

2实验部分

2.1特异性抗原分离与鸡体免疫

2.1.1抗原分离与鸡体免疫技术路线

2.1.2抗原分离与鸡体免疫实验器材

2.1.3抗原分离与鸡体免疫实验方法

2.1.4抗原分离与鸡体免疫结果分析

2.1.5抗原分离与鸡体免疫小结

2.2 IgY的分离检测和特性研究

2.2.1 IgY分离纯化技术路线

2.2.2IgY分离纯化实验器材

2.2.3 IgY分离检测和特性研究实验方法

2.2.4 IgY分离检测和特性研究结果与分析

2.2.5 IgY分离检测和特性研究小结

2.3酶标鸡卵黄抗体(IgY-HRP)的制备与特性检测

2.3.1 IgY-HRP制备与检测技术路线

2.3.2IgY-HRP制备与检测实验器材

2.3.3 IgY-HRP制备与检测实验方法

2.3.4IgY-HRP制备与检测结果分析

2.3.5 IgY-HRP制备与检测小结

2.4检测E.coli O157：H7夹心ELISA方法的建立与优化

2.4.1夹心ELISA系统建立技术路线

2.4.2夹心ELISA建立实验器材

2.4.3夹心ELISA建立与优化实验方法

2.4.4夹心ELISA建立与优化结果分析

2.4.5夹心ELISA建立与优化小结

3结论与讨论

3.1课题结论

3.1.1抗原的制备与鸡体免疫

3.1.2特异性IgY的制备

3.1.3酶标抗体的制备

3.1.4检测E.coli O157：H7夹心ELISA方法的建立

3.2讨论

3.2.1抗原成分的讨论

3.2.2IgY分离纯化的讨论

3.2.3课题需要延续的工作

3.2.4课题研究的展望

参考文献

附录

致谢

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