固定化β-葡萄糖苷酶制备龙胆低聚糖工艺研究

摘要

龙胆低聚糖(gentio-oligosaccharides)是一类新型的功能性低聚糖,具有显著增殖肠内有益菌、调节肠内菌群平衡和改善通便效果等生理功能。为了降低龙胆低聚糖的生产成本,为其工业化生产提供技术参数,本文研究了固定化β-葡萄糖苷酶(IBGL)制备龙胆低聚糖的工艺,通过葡聚糖凝胶柱层析分离得到了目的物,并采用电喷雾质谱和核磁共振氢谱对其进行了鉴定。主要研究结果如下:
　　 1.BGL的制备工艺:黑曲霉固态发酵,按料液比1:10,自然环境温度下用pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液浸提3次,浸提率可达93.82%:硫酸铵两步盐析法纯化BGL,纯化倍数为1.6倍。
　　 2.IBGL的制备工艺:质量分数为3.5%的海藻酸钠水溶液10mL与2mL适度稀释的酶液充分混合(加酶量为105U/g干载体),加入1%(v/v)的戊二醛,4℃交联3h,滴入2%的氯化钙溶液中硬化12h,所得IBGL凝胶球的酶活为17.78U/g湿凝胶,硬度为658.32g,本工艺的酶活回收率为66.34%。
　　 3.IBGL的性质:IBGL的最适反应pH为4.8,最适反应温度为65℃,米氏常数Km值为1.07mmol/L。BGL和IBGL对葡萄糖的转化率分别为47%、43%。与BGL相比,IBGL的耐受pH范围、最适温度和稳定性都有所提高。
　　 4.IBGL固定床反应制备龙胆低聚糖工艺:60%(w/v)的葡萄糖缓冲溶液,加酶量为30U/g葡萄糖,pH4.8,温度65℃,转化36h,间歇反应4次。平均葡萄糖的转化率为41.07%,IBGL的剩余酶活为82.23%。IBGL,的生产能力约为BGL的3.50倍。
　　 5.产物龙胆低聚糖的分离鉴定:
　　 1)分离条件:葡聚糖ShephadexG-10凝胶柱Φ1cm×40cm,10%乙醇洗脱,流速10mL/h,柱温50℃。产物经分离后得到了两个组份,TLC鉴定组份Ⅰ为葡萄糖,组份Ⅱ可能为生成的龙胆二糖。
　　 2)组份Ⅱ鉴定:ESI-MS测定其相对分子质量与龙胆二糖相同;1H-NMR(400MHz,D2O)δ:5.06,5.05,3.85～3.65,3.60～3.50,3.38～3.25,3.20～3.00。结合质谱、核磁共振氢谱结果,判定组份Ⅱ为龙胆二糖。
　　 6.酶法合成龙胆低聚糖体系中残留底物葡萄糖量的方法学研究:为定量测定酶法合成龙胆低聚糖得率,本文采用葡萄糖试剂盒法,通过测定转化后残留底物葡萄糖的量,间接测定龙胆低聚糖得率。该法在2小时内测定酶法合成龙胆低聚糖体系中葡萄糖量的结果稳定(RSD=0.81%),重复性好(RSD=0.97%),精密度高(RSD=1.55%),干扰小(加样回收率=101.68%)。
　　 7.成本分析:BGL制备龙胆低聚糖的总成本是IBGL的2.8倍,IBGL能显著降低龙胆低聚糖的生产成本。