两歧双歧杆菌培养及冻干保护剂的研究

摘要

双歧杆菌(Bifidobacterium)是一种能对机体产生有益作用的生理性细菌,广泛应用于功能性食品中。目前益生菌菌粉主要从国外进口,其价格高,且对国外的依赖性强,明显制约了我国益生菌产品的开发。本课题以两歧双歧杆菌BB01为试验菌株,研究了该菌的培养基、补料方式、抗冷冻因子及冻干保护剂等,确定了活菌数高的培养基组成及冻干存活率高的两歧双歧杆菌复合冻干保护剂,获得了高活性的两歧双歧杆菌菌粉。
　　 通过单因素试验、Plackett-Burman(PB)设计研究了糖类(葡萄糖、乳糖、麦芽糖及蔗糖)及益生元(低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、水苏糖和菊糖)对两歧双歧杆菌生长的影响。结果表明乳糖、葡萄糖,低聚果糖、低聚木糖,低聚半乳糖及菊糖对两歧双歧杆菌的生长有一定促进作用,以乳糖、菊糖和低聚果糖为主要影响因素,经登高试验和中心复合设计(Central Composite Design,CCD)获得优化后的复合碳源及益生元为:乳糖1.6%,菊糖0.26%,低聚果糖0.22%。活菌数在优化后的培养基中达到了(2.17±0.06)×109cfu/mL。
　　 在复合碳源及益生元优化培养基的基础上,保持MRS无机氮源不变,采用PB试验设计筛选蛋白胨、牛肉膏、酵母粉和酪蛋白水解物有机氮源主因子,再经登高试验及CCD试验设计最终得到复合氮源为:蛋白胨0.9%,酵母浸粉0.3%,牛肉膏0.7%。培养基优化后,发酵液中活菌数达到了(2.49±0.06)×109cfu/mL,较MRS(乳糖)培养基提高了65.46%。
　　 研究了补料时间和中和剂对两歧双歧杆菌生长的影响,结果表明在培养13h后添加1mol/L的NaOH不仅延长了两歧双歧杆菌的对数生长期,同时能显著提高培养液中的活菌数,使其在20h时达到最大值(3.52±0.046)×109cfu/mL,比对照组18h时的最大值(2.4±0.03)×109cfu/mL提高了29.26%。
　　 通过单因素试验、PB试验设计和Box-Behnken试验设计研究了NaCl、山梨醇、甘露醇、谷氨酸、谷氨酸钠和甜菜碱等抗冷冻因子添加到MRS优化培养基中对两歧双歧杆菌冻干的影响,获得两歧双歧杆菌抗冻因子为:NaCl0.74%、山梨醇0.08%、谷氨酸0.02%。此条件下冻干存活率达到了75.2±0.4%,较对照组提高了32.65%。
　　 在MRS优化培养基基础上,采用响应面法对两歧双歧杆菌冻干保护剂进行了分类优化。最终得到两歧双歧杆菌益生元类保护剂的最佳配比:低聚木糖7%,菊糖13%,水苏糖11%,此条件下存活率为88.7±1.4%,较对照组提高了15.33%;氨基酸及盐类保护剂最佳组合为:甘氨酸5.5%,精氨酸4.5%,碳酸氢钠0.8%,抗坏血酸2.3%,此条件下存活率为87.8±2.3%,较对照组提高了15.83%。
　　 在前期试验结果基础上,将筛选得到的抗冻因子添加到培养基中,对试验得到的保护剂因子和脱脂乳一并进行响应面优化,确定了复合冻干保护剂为:甘氨酸5.5%,碳酸氢钠0.8%,低聚木糖7%,精氨酸4.5%,脱脂乳25%。此条件下存活率达到了90.37±1.9%,单位菌粉活菌数达到了(2.78±0.13)×1011cfu/g,且菌粉产量达到6.67g/L。
　　 研究得到的两歧双歧杆菌优化培养基,能有效提高培养液中的活菌数,延长菌体生长周期;同时抗冷冻因子与复合冻干保护剂的配合使用,不仅降低了冻干制备菌粉的成本、提高了菌粉产量,同时提高了菌粉活菌数及存活率,为进一步工业化生产奠定了技术基础。