魔芋ACE抑制肽分离纯化及体外降血压活性研究

摘要

ACE抑制肽（Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides）是一种对ACE活性具有抑制作用的多肽类物质。ACE抑制肽通过竞争性的与ACE发生结合，能够阻断具有升血压活性的血管紧张素II生成，促进具有降血压活性的舒缓肽和脑啡肽生成，从而起到降血压作用。ACE抑制肽具有分子量小、生物利用度高、对人体无过敏性等特点。目前，ACE抑制肽的来源和制备方法已经成为国内外研究的热点之一。
　　据报道，我国魔芋精粉年产量已超过5000吨，在魔芋精粉加工过程中会产生重量轻、颗粒小的粉末，称为魔芋飞粉，约为精粉产量的30％～40%。魔芋飞粉大多被直接废弃掉，只有极少一部分被利用。研究表明，魔芋飞粉中含有丰富的蛋白质，直接酶解魔芋蛋白质可获得ACE抑制肽。因此，魔芋飞粉有可能是一种制备ACE抑制肽的天然药物新资源。
　　本文以魔芋飞粉为原料，采用碱溶酸沉法提取魔芋蛋白质，直接酶解魔芋蛋白质制备ACE抑制肽。采用超滤法、Sephadex G-15柱层析及反相高效液相色谱法（RP-HPLC）对酶解液进行分离纯化，得到了纯度较高的魔芋ACE抑制肽，并且对其进行体外降血压活性检测及结构分析。研究内容及结果主要有：
　　（1）采用碱溶酸沉法提取魔芋蛋白质。以ACE抑制率和水解度为考察指标，利用菠萝蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶、风味蛋白酶、胶原蛋白酶酶解魔芋蛋白制备ACE抑制肽。通过单因素试验和正交试验优化魔芋ACE抑制肽的酶解工艺条件。结果表明：最佳水解用酶为碱性蛋白酶。在设定的酶解条件下，酶解pH值对ACE抑制率影响显著，酶解温度、底物浓度、酶用量对其影响不显著。得出魔芋ACE抑制肽的最佳酶解工艺条件为：酶解pH为10、底物浓度为3%、酶解温度为46℃、酶用量5000U/g、酶解时间3h，酶解液的ACE抑制率为82.02%。
　　（2）魔芋ACE抑制肽分离纯化。以膜通量和ACE抑制率为考察指标，采用规格为10、5、1KDa的超滤膜进行超滤法分离，结果1KDa的超滤膜对魔芋ACE抑制肽的分离效果最好。对分离条件进行优化，得到最佳分离条件为：料液pH为9、超滤压力为0.07MPa、超滤时间为15min，分离后所得粗品的ACE抑制率为85.30%，膜通量为38L/m2·h。
　　以ACE抑制率为考察指标，采用Sephadex G-15柱层析对超滤后的魔芋ACE抑制肽粗品进行分离，确定出Sephadex G-15柱层析的最佳分离条件为：样品浓度为120mg/mL、流速为0.8mL/min、上样量为1.0mL，分离后组分的ACE抑制率为90.20%。
　　采用反相高效液相色谱法对Sephadex G-15柱层析分离后的组分进行纯化，得到峰Ⅰ和峰Ⅱ处两个组分，峰Ⅰ处组分的ACE抑制率为24.35%，峰Ⅱ处组分的ACE抑制率为92.85%。采用紫外分光光度法测得纯化后样品中魔芋ACE抑制肽的含量为77.20%。
　　（3）魔芋ACE抑制肽结构分析。运用氨基酸分析仪从魔芋ACE抑制肽中检测出了16种氨基酸，其中精氨酸、谷氨酸、天门冬氨酸含量较高。采用紫外全波长扫描确定魔芋 ACE抑制肽的最大吸收波长为218.0nm，与ACE抑制肽标准品的紫外扫描结果一致。采用红外光谱扫描对魔芋ACE抑制肽样品进行分析检测，结果表明：样品及ACE抑制肽标准品所表现出的红外光谱特征基本一致，其结构中均存在酰胺键、C-C、C-H、O-H、C-N、C=O等基团。采用凝胶渗透色谱法对魔芋ACE抑制肽的分子量及分子量分布进行测定，结果表明其峰值分子量分别为262Da、634Da，其分子量分布范围为：200～700 Da。
　　（4）魔芋ACE抑制肽体外降血压活性检测。高效液相色谱法检测结果表明：魔芋ACE抑制肽对ACE的抑制活性为58.90%。紫外分光光度法测得其半数抑制浓度IC50为11.09μg/mL。

目录

1 绪论

1.1 魔芋的研究与应用

1.1.1 魔芋资源分布

1.1.2 魔芋成分与应用

1.1.3 魔芋药用价值

1.2 魔芋飞粉研究现状

1.2.1 魔芋飞粉的主要成分

1.2.2 魔芋飞粉研究与应用

1.3 ACE抑制肽研究概况

1.3.1 ACE抑制肽简介

1.3.2 ACE抑制肽来源

1.3.3 ACE抑制肽制备

1.3.4 ACE抑制肽分离纯化

1.4 ACE抑制肽的活性

1.4.1 ACE与高血压的关系

1.4.2 ACE抑制肽活性机理

1.4.3 ACE抑制肽活性检测方法

1.5 立题背景与意义

1.5.1 立题背景

1.5.2 立题意义

1.6 研究内容

2 魔芋ACE抑制肽酶解工艺研究

2.1 材料与仪器

2.1.1 材料与试剂

2.1.2 仪器与设备

2.2 实验方法

2.2.1 水解度测定

2.2.2 ACE抑制率测定

2.2.3 魔芋蛋白等电点测定

2.2.4 魔芋蛋白质提取

2.2.5 魔芋ACE抑制肽酶解工艺

2.2.6 魔芋ACE抑制肽酶解工艺影响因素考察

2.2.7 魔芋ACE抑制肽酶解工艺条件优化

2.2.8 数据处理

2.3 结果与讨论

2.3.1 魔芋蛋白等电点测定结果

2.3.2 魔芋蛋白提取结果

2.3.3 蛋白酶的确定

2.3.4 魔芋ACE抑制肽酶解工艺影响因素考察结果

2.3.5 魔芋ACE抑制肽酶解工艺条件优化结果

2.4 本章小结

3 魔芋ACE抑制肽分离纯化

3.1 材料与仪器

3.1.1 材料与试剂

3.1.2 仪器与设备

3.2 实验方法

3.2.1 ACE抑制率测定

3.2.2 膜通量测定

3.2.3 超滤法分离魔芋ACE抑制肽

3.2.4 魔芋ACE抑制肽Sephadex G-15柱层析分离

3.2.5 魔芋ACE抑制肽RP-HPLC纯化

3.2.6 魔芋ACE抑制肽含量测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 超滤法分离结果

3.3.2 魔芋ACE抑制肽Sephadex G-15分离结果

3.3.3 魔芋ACE抑制肽RP-HPLC纯化结果

3.3.4 魔芋ACE抑制肽含量测定结果

3.4 本章小结

4 魔芋ACE抑制肽结构分析

4.1 材料与仪器

4.1.1 材料与试剂

4.1.2 仪器与设备

4.2 实验方法

4.2.1 紫外全波长扫描

4.2.2 红外光谱扫描

4.2.3 魔芋ACE抑制肽氨基酸组成分析

4.2.4 魔芋ACE抑制肽分子量及分子量分布测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 紫外全波长扫描结果

4.3.2 红外光谱扫描结果

4.3.3 魔芋ACE抑制肽氨基酸组成分析结果

4.3.4 魔芋ACE抑制肽分子量及分子量分布测定结果

4.4 本章小结

5 魔芋ACE抑制肽降血压活性检测

5.1 材料与仪器

5.1.1 材料与试剂

5.1.2 仪器与设备

5.2 实验方法

5.2.1 马尿酸检测波长测定

5.2.2 魔芋ACE抑制肽体外降血压活性检测

5.2.3 魔芋ACE抑制肽半数抑制浓度IC50测定

5.2.4 阳性对照品半数抑制浓度IC50测定

5.3 结果与讨论

5.3.1 马尿酸检测波长确定

5.3.2 魔芋ACE抑制肽体外降血压活性检测结果

5.3.3 魔芋ACE抑制肽半数抑制浓度IC50测定结果

5.3.4 阳性对照品半数抑制浓度IC50测定结果

5.4 本章小结

6 结论与展望

6.1 结论

6.2 展望

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表文章

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