苦茶活性成分四甲基尿酸对镉诱导小鼠氧化损伤的保护作用及机制研究

摘要

镉（Cadmium，Cd）是一种不易降解的环境污染物，对人类及动植物都具有严重的毒性，有研究已明确镉致肝脏及肾脏的毒性与自由基的过量产生及氧化压力(oxidative stress，OS)的积累是有联系的，因此，为减轻镉致的氧化损伤，寻找更安全有效的抗氧化物已成为现阶段的研究热点。其中，苦茶中的天然活性成分四甲基尿酸(theacrine)因其清除自由基的能力十分突出，有望成为新型的镉损伤保护试剂。本课题旨在研究theacrine对镉诱导的小鼠保护作用，并对其可能的机制进行初探。 本实验通过腹腔注射CdCl2，构建镉诱导氧化损伤小鼠模型，以苦茶提取物theacrine作为保护药物，通过生理生化指标及组织形态学进行模型验证。同时，从体外和体内抗氧化、氧化指标及炎症因子和元素分析等多方面探讨了镉致小鼠氧化损伤的发病机制及theacrine的保护机制，为镉致氧化损伤的临床诊断及抗镉药物的开发提供数据支持和理论依据。 (1)镉致小鼠损伤模型的建立及模型验证 昆明小鼠随机分为空白对照组、镉损伤组、theacrine低中高3个浓度梯度的保护组，镉损伤组小鼠腹腔注射CdCl2，其余三组腹腔注射CdCl2后灌胃不同浓度的theacrine进行保护。经生理生化指标及组织形态学分析，验证模型构建成功。生理指标结果表明注射CdCl2的损伤组小鼠进食量明显减少，给予保护药后呈依赖性增加。生化指标结果检测表明血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)较空白组相比，镉损伤组均有降低(P＜0.05，P＜0.01)，低密度脂蛋白(LDL-C)、血肌酐(CRE)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)较空白组相比，损伤组明显升高(p＜0.01，p＜0.01，p＜0.01，P＜0.01)，说明镉致损伤可使小鼠体内的生化指标发生紊乱，给予theacrine保护后，其损伤得到了明显的改善，同时检测DNA损伤分析及组织形态学观察小鼠肝脏和肾脏组织病理变化，验证镉致小鼠损伤模型构建成功，且theacrine对镉致小鼠损伤模型具有一定的保护作用，在30mg/kg/day剂量下保护作用最显著。 (2)theacrine对镉致小鼠氧化损伤的保护机制初探 通过theacrine体外抗氧化实验，表明theacrine对超氧阴离子、羟自由基及DPPH·均具有清除能力。同时通过检测镉致小鼠氧化损伤组，theacrine保护组中肝脏和肾脏的氧化指标蛋白羰基化(PCO)及丙二醛(MDA)，炎症因子一氧化氮(NO)，抗氧化体系超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)及过氧化氢酶(CAT)，结果表明镉的毒性作用诱导损伤组各氧化指标MDA、PCO含量显著高于对照组(P＜0.05)，炎症因子NO含量上升(P＜0.05)，抗氧化酶SOD、GSH、CAT活性明显低于对照组(P＜0.05)，给予theacrine保护后氧化指标的上升得到抑制，抗氧化酶活性出现上升。说明theacrine能够减少镉致小鼠氧化损伤，起到保护作用;进一步对theacrine的金属螯合能力进行了研究，结果表明，与Cd2+的螯合作用，螯合率最大达60％左右;通过对肝脏、肾脏组织中的Cd2+、Cu2+、Fe2+、Zn2+的含量进行分析，结果显示镉的毒性作用导致小鼠肝脏、肾脏组织中各元素发生显著的变化，theacrine的保护能够缓解元素的变化趋势;为进一步讨论镉的遗传毒性，提取出全基因组，对肝细胞DNA的损伤借助琼脂糖凝胶电泳进行定性分析，theacrine保护组可阻止DNA分子片段化;结果显示theacrine对镉致小鼠氧化损伤的保护作用机制受多方面的影响，一方面可能是通过抑制体内自由基及炎症因子的产生，清除已有自由基，另一方面是螯合体内的Cd2+，减少Cd2+在肝脏及肾脏中的蓄积，减少其对体内必需金属元素平衡的干扰，因此本研究为进一步阐明theacrine对镉致小鼠氧化损伤的保护及可能机制提供科学依据。

目录

摘要

1绪论

1．1镉的研究现状

1．1．1镉的研究背景

1．1．2镉污染

1．1．3镉的毒性机制

1．2镉对肝脏及肾脏的影响

1．2．1肝脏及肾脏的基本结构及功能

1．2．2镉对肝脏及肾脏的影响

1．3苦茶及其有效成分四甲基尿酸的研究

1．3．1苦茶的研究

1．3．2四甲基尿酸的研究

1．4本课题研究目的、意义

1．5本课题研究内容

2镉致小鼠损伤模型的建立及模型验证

2．1实验材料

2．1．1实验试剂

2．1．2实验仪器

2．2建模方法

2．3模型验证

2．3．1各组小鼠生活状况观察

2．3．2生理指标变化及脏器系数

2．3．3血清中生化指标的检测

2．3．4组织形态学石蜡切片观察

2．3．5 DNA损伤检测

2．4结果与讨论

2．4．1小鼠生长情况及生理指标变化

2．4．2小鼠血清生化指标的检测结果

2．4．3组织形态学结果

2．4．4 DNA损伤分析

2．5讨论

2．6本章小结

3苦茶提取物对镉致小鼠损伤机理的探究

3．1实验材料

3．1．1实验试剂

3．1．2实验仪器

3．2实验方法

3．2．1苦茶提取物对镉致损伤小鼠体外抗氧化实验研究

3．2．2苦茶提取物对镉致损伤小鼠体内氧化、抗氧化及炎症因子的测定

3．2．3苦茶提取物与金属Cd2+的螯合实验

3．2．4苦茶提取物对镉致损伤小鼠元素变化分析

3．3结果

3．3．1苦茶提取物对镉致损伤小鼠体外抗氧化实验研究

3．3．2苦茶提取物对镉致损伤小鼠体内氧化、抗氧化及炎症因子的测定

3．3．3苦茶提取物四甲基尿酸与金属Cd2+的螯合实验

3．3．4苦茶提取物对镉致损伤小鼠元素变化分析

3．4讨论

3．5本章小结

4总结

4．1结论

4．2创新点

4．3展望

致谢

参考文献

附录

攻读学位期间发表的学术论文

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