TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶的表达纯化及其抗病毒活性的初步研究

摘要

该研究中首先将乙肝病毒靶向核糖核酸酶(HBV targeted ribonuclease,TR)基因及其对照—突变失活的乙肝病毒靶向核糖核酸酶(mutant targeted ,TRmut)基因、乙肝病毒核心蛋白(HBV core protein ,HBVc)基因、人嗜酸性粒细胞来源的神经毒素(human eosinophil derived neurotoxin,hEDN)基因,分别克隆入含有蛋白转导域TAT的pTAT-HA原核表达载体.在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内,以IPTG诱导融合蛋白表达,表达产物用SDS-PAGE及Western blot分析鉴定.优化表达条件后大量表达,在变性条件下以Ni-NTA-agrose和PD-10脱盐柱进行纯化.纯化产物的浓度及纯主分析表明,成功地纯化了四种TAT融合蛋白.以构建的pET-30a(+)/TR、pET-30a(+)/TRmut及pET-30a(+)/HBVc转化大肠杆菌BL21(DE3)LysS,相同方法表达并纯化不含TAT的对照蛋白.将四种TAT融合蛋白及其对照分别加入培养的2.2.15细胞上清中,利用间接免疫荧光法检测TAT融合蛋白的跨膜转导效率发现:经TAT融合蛋白处理的细胞,胞浆中均出现较强的绿色荧光;而经不含TAT的对照蛋白处理品的细胞则没有荧光出现.这一结果显示制备的TAT融合蛋白可以高效的导入2.2.15细胞.我们采用固相放免法检测TAT-TR的抗病毒活性发现:与MOCK相比加有TAT-TR的实验组细胞上清中HBeAg的浓度下降了60.3﹪;而TRmut、hEDN和HBVc组细胞上清中的HBeAg浓度与MODK组的差异无统计学意义,说明制备的TAT-TR具有较好的抗病毒活性.

目录

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英文缩写词注

前言

研究内容

第一部分TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶原核表达载体及其对照质粒的构建

第二部分TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶及其对照蛋白的表达和纯化

第三部分TAT融合蛋白跨膜转导的检测

一对照蛋白的表达、纯化

二PTD介导融合蛋白跨膜转导的检测

第四部分TAT-乙肝病毒靶向核糖核酸酶抗病毒作用的初步检测

小结

参考文献

文献回顾

第一部分乙型肝炎治疗的现状及研究进展

第二部分HIV-TAT蛋白转导域在医学中的应用

致谢