Linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶的构建及其抗病毒活性的研究

摘要

HBV感染是当今最严重的健康问题之一,常会引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌.为了更好的观察和证实我们构建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶在体内的作用,该实验换用重组腺病毒载体RAd为后续的体内试验及功能研究打下基础.首先构建带目的片段的腺病毒穿梭质粒,将各目的片段TR-L、TR、TRmut、HBVc、hEDN,克隆入腺病毒穿梭质粒pDC316.在293细胞中包装形成含目的片段重组腺病毒、鉴定、扩增及滴度测定.获得的各病毒滴度分别为(10<'7>pfu/m1):RAd/TR-L:4.1;RAd/TR:4.5:RAd/TRmut:3.7;RAd/hEDN:5.6;RAd/HBVc:6.3;RAd/空:5.7.用获得的重组腺病毒感染2.2.15细胞后,IFA显示,感染RAd/TR-L的2.2.15细胞出现较强绿色荧光,说明RAd/TR-L在2.2.15细胞内有表达.以重组腺病毒分别感染2.2.15细胞,同时设立空感染为全阴性对照,48小时后提取细胞上清,应用RIA测定HBsAg、HBeAg含量显示,RAd/TR-L及RAd/TR细胞上清中HBsAg、HBeAg的浓度与其它对照组相比有明显下降(P<0.01),各对照组浓度差异没有统计学意义(P>0.05);TR-L组与TR组相比有差异(P<0.05).TR-L组与空感染组相比,上清中HBsAg、HBeAg的浓度分别下降了65.3％、62.7%.荧光定量PCR法测定上清HBV-DNA含量:TR-L组与TR组细胞上清中HBV-DNA的含量与对照组相比有明显下降(P<0.01),各对照组含量差异没有统计学意义(P>0.05);TR-L组与TR组相比有差异(P<0.05).TR-L组与空感染组相比,浓度下降了59.9%.各组细胞感染后观察形态与感染前无差别,MTT比色分析显示,各组间差别无统计学意义,说明细胞增殖未受抑制.以上结果表明,linker的插入可能通过优化HBVc和hEDN分子之间的空间构象降低其空间位阻而增强TR的抗HBV效率.尽管诸多实验条件如细胞状态、细胞数量、细胞代数等不同,但从TR-L真核表达载体及TR-L重组腺病毒载体抗HBV的效率上我们可初步推断出应用腺病毒载体较真核表达载体抗HBV的效率可更高些,与预期的结果相一致,但尚需更深入的实验证明.总之,该研究为我们进一步探索其体内抑制HBV的实验奠定基础.

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前言

文献回顾

研究内容

第一部分HBV TR-L真核表达载体构建表达及抗病毒作用的检测

1 HBV TR-L真核表达载体的构建

2 乙肝病毒靶向核酸酶在2.2.15细胞中的表达

3 HBV TR-L抗病毒作用的检测

4讨论

第二部分HBV TR-L重组腺病毒载体的构建及抗病毒作用的检测

1 HBV TR-L重组腺病毒载体的构建

2 以重组腺病毒为载体的HBV TR-L在2.2.15细胞中的表达

3 以重组腺病毒为载体的HBV TR-L抗病毒作用的检测

4讨论

小 结

参考文献

附 录

个人简历和研究成果

致 谢