诱导成年和幼年啮齿类动物多发性硬化模型的差异性比较及其相关机制研究

摘要

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统(central nervoussystem，CNS)慢性炎症性脱髓鞘疾病，具有复发、迁延及致残率高的特点。 全世界每年将近有两百万病人，发病人群以20岁～40岁的青中年人为主，被认为是成年人由于神经系统疾病而致残的主要病种之一。而儿童在MS发病上由于临床表现和发病特点更富有变化性和不典型性，并且容易和急性播散性脑脊髓炎（acute disseminated encephalomyelitis，ADEM）、多发性脱髓鞘性脑脊髓炎（multiple demyelinated encephalomyelitis，MDEM）等疾病相混淆，临床上较难确诊。以前的统计报道认为儿童MS的发病率很低，15岁之前发病患者的比例大约是1.35～2.5/100000，近几年随着诊断技术的不断提高，儿童多发性硬化症患者的比例不断上升，相关病例报道和临床回顾性研究日渐增多，但其间关于儿童MS的临床表现、病程特点、预后转归以及与成人多发性硬化之间的区别和联系观点说法不一，有的甚至相互矛盾。因此，用实验的方法来探讨和证实多发性硬化的发病率、临床症状、病理特征和预后在年龄上的倾向性，以及这种倾向性所具有的相关机制，对于研究多发性硬化症的发病机理和保护性机制有着重要意义。 本研究首先制备成年组和幼年组(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)豚鼠动物模型，将成年动物分为成年（5 周龄）实验组（n=10）、成年实验对照组（n=5）；幼年动物分为幼年（7～8 天）同等剂量组（甲组，n=5）、幼年双倍剂量组（乙组，n=5）、幼年实验对照组（n=5）。用髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）加完全福氏佐剂（completely freund adjuvant，CFA）的方法进行免疫。自致敏日起观察28 天，每日定时采用盲法由至少两名观察者对豚鼠进行EAE 症状学评估，观察对比两组动物在发病率、临床症状以及预后转归上的异同点。并分别采用描述性统计方法及两组等级资料的秩和检验统计分析方法比较幼年组和成年组动物的发病严重程度。结果显示两个年龄组动物在发病率和症状学评分上差异显著：成年实验组动物全部发病，幼年实验组（包括甲组和乙组）只有4 只动物有轻度肢体行走不稳和翻正反射减弱等轻微症状，并且在第22 天后逐渐恢复正常；成年实验组在发病早期和高峰期6 只动物的病情较重，其中2 只死亡，在转归期（第21、22 天开始至第28 天观察截止）大多数动物仍然遗留明显残疾，EAE 模型建立成功。然后采用病理学方法观察两组动物小脑和脊髓组织的变化：HE 染色显示炎症反应程度；LFB 能够针对髓鞘特异性着色，可以显示髓鞘脱失情况；噬银染色能够特异性观察轴突损伤。 结果： 成年和幼年实验组在病理变化上的严重程度区别明显：成年实验组6 只动物的脊髓病理切片上可见大量炎症细胞浸润，多个血管“袖套样”改变（perivascular cuffing）病灶，并伴有大片髓鞘脱失和轴索连续断裂；另外4 只动物的炎症浸润以及侵害相对较少，这与临床症状一致。而幼年实验组只在2 只动物的组织切片上发现少量病灶，包括炎症细胞浸润病灶、髓鞘脱失及轴索断裂。但这些病理改变并未引起幼年豚鼠出现相应的神经系统受损症状，与临床表现不太吻合。其余幼年实验组豚鼠未能在组织上发现明显病理改变。 结论： 本次实验观察幼年动物在EAE 的发病率上确实比成年动物低，病情轻，而且给予双倍致敏剂也未诱发明显症状。由此可以推论幼年动物在炎性脱髓鞘自身免疫性病的发生上可能存在着某种和年龄相关的保护性机制，从而在EAE 的发病过程中起着抑制、减轻和延缓的作用。 本次研究进一步探讨了与年龄相关的一些保护性因子在发育过程中的变化。S100B是脑组织S100家族中最丰富的成分，这种21kDa的钙离子结合蛋白，在中枢神经系统主要由星型胶质细胞（Astrocyte，AST）生成和释放。S100B执行多种功能，例如促进皮层和脊髓神经元轴突的生长，刺激胶质细胞增殖，参与胶质细胞成熟过程并提高其生存能力，在神经系统的发育和维持中发挥重要作用。转化生长因子TGF-β（transforming growth factor-β）是哺乳动物体内一种重要的细胞因子，参与细胞的生存、调亡、繁殖、分化以及炎症反应。研究报道新生的TGF-β基因敲除小鼠可以导致变性神经元的大量增生并伴随突触素、层粘连蛋白、微珠蛋白的表达减少以及神经元对毒性损伤的易感性增加。而星型胶质细胞过量表达TGF-β则可以保护急、慢性以及兴奋性中毒损伤所导致的神经退行性变。本次实验想通过观察S100B和TGF-β在生后发育中的变化，以期揭示二者在正常发育和病理状态下的作用和意义。