RNA结合蛋白QKI在造血系统髓系分化中的表达调控及其功能研究

摘要

髓系是造血系统分化发育过程中一支重要的谱系，其进一步分化成熟产生单核/巨噬细胞和粒细胞，这两类细胞是机体固有免疫的主要组成者，是机体实施免疫反应、炎症反应和创伤修复的重要分子，因此研究这两类细胞的分化有着重要的生理意义。而目前认为，在细胞因子的作用下，细胞内特定基因的表达或关闭在细胞分化过程中起着主导的地位,其调控异常是造血系统肿瘤发生启动因素和治疗靶点。因此发现和深入研究这些基因表达调控的机制有助于认识肿瘤发生发展机制,为肿瘤的防治提供重要依据.
　　QKI是一类RNA结合蛋白，由于其上游调控区的部分缺失引起组织特异性的QKI表达降低导致神经髓鞘发育障碍，小鼠出生后10天出现严重的震颤表型，故命名为QKI（quaking）。它属于RNA结合蛋白STAR（signalsTransductionsActivatorsofRNAs）家族，此蛋白结构具有结合上游蛋白激酶的SH3结构域，同时又具有RNA结合蛋白的结构特征，具有介导上游蛋白激酶和调控下游基因表达的双重角色，是重要的功能分子。目前对于它的研究大部分集中在中枢神经系统中。QKI主要通过调控髓鞘形成过程中重要分子，如MBP、MAG等的表达来参与髓鞘的形成。作为RNA结合蛋白，QKI对靶分子的调控主要是通过识别并结合于mRNA3’UTR上的特定序列即QKI反应元件（QRE）来调控其表达。这一调控发生在mRNA细胞内的定位、mRNA的稳定性以及翻译效率的改变等多个环节。
　　除了在神经系统外，QKI还在多种组织和器官中广泛表达，参与多个系统的发育和细胞增殖、分化与凋亡。一些ENU诱导的QKI纯合突变的小鼠出现胚胎致死表型，目前认为与卵黄囊时期的胚胎造血异常密切相关。在2005年发表于NatStructMolBio上的一篇文章中预测的众多QKI靶分子中，有部分与造血系统髓系分化密切相关。因此我们将QKI的研究集中在造血系统髓系的分化与发育上。
　　首先，我们在白血病细胞HL-60和THP-1的诱导分化模型中发现，造血系统髓系向单核/巨噬系和粒系分化过程中，QKImRNA和蛋白表达水平均明显降低，可能与转录抑制有关。利用生物信息学分析QKI上游启动子区约2000bp，发现多个调控髓系分化的重要转录因子的结合位点；其中转录因子C/EBPα的表达水平变化与QKI一致，且QKI的变化发生在C/EBPα变化之后，提示QKI可能是C/EBPα的下游分子；进一步利用QKI启动子的荧光素酶报告系统检测和体内的ChIP实验进一步证实C/EBPα直接结合于QKI启动子距起始码ATG上游约1872bp-2036bp处上调其表达；随着分化的进程，由于C/EBPα的减少，结合于QKI启动子的C/EBPα减少，导致表达水平的下降。
　　单核/巨噬细胞分化过程中蛋白表达分析发现，决定单核/巨噬细胞谱系定向分化的特异性分子单核巨噬细胞集落刺激因子受体CSF1R（Macrophage-colonystimulatingfactorreceptor，M-CSFR,又称为CSF1R）与QKI的表达趋势相反；在细胞内干涉或过表达QKI后，CSF1R也出现相反的表达变化，CSF1R是QKI的一个下游分子并受其负调控；在NCBI数据库中查找并比对不同种属间CSF1R3’UTR的序列，发现在人、牛、小鼠和猫之间同源性很高且均含有一个或两个QKI反应元件；将CSF1R3’UTR构建报告基因同时结合体内的RNA-IP实验证实QKI直接作用于CSF1R3’UTR降低其mRNA的稳定性而负调控CSF1R的表达。由此证实，在单核/巨噬细胞分化过程中，QKI表达水平的降低解除了对CSF1RmRNA的降解，使其表达水平升高，接受配体M-CSF信号的刺激，促使前体细胞一步步向单核/巨噬细胞分化。
　　粒细胞分化模型中发现，在10％血清条件下，ATRA诱导HL-60细胞不完全分化，以细胞周期阻滞为主要效应时，QKI表达无明显变化；在2％血清条件下，ATRA诱导绝大部分细胞分化为成熟的粒细胞，QKI在mRNA和蛋白水平均明显降低；改用另一较强的诱导分化剂DMSO，使大部分细胞快速分化为成熟的粒细胞时，QKI在mRNA和蛋白水平出现明显迅速的降低。由此看出，QKI的降低速度和程度与细胞分化的速度与程度呈正比；在这一过程中，QKI与C/EBPα的变化一致，因此QKI的降低与C/EBPα调控的减弱有关。另外，在粒系分化过程中，转入siRNA加速内源QKI的降低，细胞核形态检测发现前体细胞立即分化为成熟的粒细胞。由此初步得出结论，QKI在粒细胞的终末分化和活化中发挥重要调控作用。深入的机理研究正在进行当中。
　　此外，为了在血液细胞中实现QKI过表达来进行深入的功能研究，我们还构建和包装了过表达QKI的慢病毒，目前已能够成功感染贴壁细胞并实现稳定过表达QKI。
　　通过本课题的研究，首先，我们加深了对造血系统髓系分化的认识，首次提出RNA结合蛋白在这一过程中发挥重要作用。它不仅是受髓系分化重要转录因子C/EBPα直接调控的一个新的靶分子，还能够直接对细胞因子受体CSF1R进行转录后调控，决定单核/巨噬细胞能否正常分化；其次，进一步认识了转录后调控机制，发现了QKI新的功能和作用机制；再次，鉴于C/EBPα在细胞周期和脂肪等组织分化中的功能，及其CSF1R与生殖系统肿瘤和乳腺癌的发生密切相关，由此将QKI的功能研究拓展到多个领域，同时为相关疾病的诊治提供新的思路和治疗靶点；最后，我们还建立了慢病毒系统的平台，为后续实验提供有力的技术保障。

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前言

文献回顾

造血细胞的分化与发育

一、造血的发生和造血细胞的来源

二、造血细胞的分裂增殖与分化发育

三、造血微环境在造血细胞分化发育中的作用

造血系统髓系的分化发育调控

一、概述

二、转录调控与转录因子1、转录调控

三、转录后调控与巨噬细胞集落刺激因子受体（CSF1R） 1、转录后调控机制

RNA结合蛋白QKI

一、 STAR家族

二、QKI 的结构、亚细胞定位和表达

三、QKI 的功能研究

四、QKI对靶分子调控的机制

正文

第一部分RNA 结合蛋白 QKI 在髓系单核/巨噬细胞分化中的表达调控及其功能研究

实验一 QKI 在单核/巨噬细胞分化中的表达变化

实验二 QKI 在单核/巨噬细胞分化中的转录调控机制

实验三 QKI 在单核/巨噬细胞分化中的功能研究

第二部分RNA 结合蛋白 QKI 在髓系粒细胞分化中的表达调控及其功能研究

实验一 QKI 在粒细胞分化中的表达变化

实验二 QKI 在粒细胞分化中的转录调控机制及其

第三部分慢病毒的制备

1 材料、试剂与仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

总结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢