RNA结合蛋白QKI-5对FoxO1的转录后调控在维甲酸抑制乳腺癌细胞增殖中的功能研究及新基因Apr3参与维甲酸诱导细胞周期阻滞的功能研究

摘要

QKI是一类RNA结合蛋白，在神经系统中表达含量很高，基因部分缺失小鼠由于神经髓鞘发育障碍，在出生后10天出现严重的震颤表型。尽管关于QKI的研究主要集中于在神经系统领域，但是在神经系统以外的器官，如心，肺，睾丸，也有广泛表达。 在神经系统中的研究发现，QKI-6, 7主要在细胞浆负责目的RNAs 的运输及参与稳定性的调控。QKI-5可与目的转录本结合将其滞留在细胞核，但是关于其更多的功能研究却未见报道。 除了在神经系统中对于髓鞘的形成发挥重要功能以外，QKI蛋白在血管发育，凋亡，细胞黏附，细胞生长及形态形成和器官发生等方面具有举足轻重的功能。根据RNA 结合蛋白QKI-5对目的基因3’UTR的结合具有特异性以及到目前为止经实验验证的结合位点，我们在通过生物信息学预测的1430个靶基因中选择FoxO1作为我们的研究对象。主要基于以下几方面的原因。 一、对转录因子FoxO1的功能研究发现，FoxO1主要参与细胞的新陈代谢、氧化应激、细胞周期调控、凋亡、衰老以及血管发育等生命过程，与QKI的功能存在某种程度的交叉。如在QKI-5以及FoxO1基因分别敲除的小鼠中，都观察到由于血管发育障碍导致的胚胎致死表型，进一步研究发现这两种敲除小鼠中都存在维甲酸通路功能障碍。 二、对FoxO1 的mRNA 的3’UTR 进行了生物信息学分析，发现在其3’UTR 存在三个十分保守的QKI-5 结合位点。同时软件预测发现FoxO1 的3’UTR 在物种间高度保守，且二级结构复杂度非常高，暗示它的3’UTR 具有生物学功能，提示可能有转录后调控的存在。 为了验证QKI-5 对FoxO1 存在转录后调控，我们首先构建含FoxO1 的3’UTR 的荧光素酶报告系统，发现QKI-5 能够明显降低报告系统的活性，提示是一种转录后负性调控。通过RNA 免疫共沉淀实验证实QKI-5 可与FoxO1的3’UTR 特异结合，提示二者之间在细胞内存在相互作用。在此基础上为了进一步验证它们之间的相关性，通过人为升高和降低QKI-5 的表达，观察到FoxO1 与QKI-5 的表达存在负相关。提示QKI-5 可能通过转录后水平参与调控FoxO1 的表达。那么，QKI-5 对FoxO1 的这种转录后调控在何种情况下发生且具有什么生理意义呢？ 在RA诱导乳腺癌细胞周期阻滞的模型中，我们检测到QKI-5和FoxO1的表达均明显上升。运用siRNA技术特异沉默QKI-5 之后，FoxO1及其相关细胞周期蛋白cyclin D1和P27均发生明显改变，使RA诱导后MCF-7细胞周期阻滞进程发展加快。进一步分析QKI对FoxO1的作用机理，特异沉默QKI-5表达组，FoxO1 mRNA稳定性增强。提示QKI-5介导了RA 引起FoxO1mRNA 稳定性下降的过程。由于RA诱导之后，FoxO1的mRNA整体水平是升高的，QKI-5对FoxO1的负性调控具有什么意义呢？结合FoxO1的功能考虑，我们在RA抑制MCF-7细胞增殖模型中，通过SA-gal 细胞衰老功能实验发现特异沉默QKI-5表达实验组，RA诱导后，细胞衰老的发生率与未沉默组比较明显增加，提示，正是由于QKI-5对FoxO1的负性调控延缓了FoxO1的快速升高所致的细胞衰老，从而使ATRA对细胞周期的精细调控朝着诱导分化或凋亡的途径进行。 本实验不但证实QKI-5可与FoxO1的3’UTR结合，并且是通过影响了FoxO1的mRNA稳定性发挥转录后负性调控作用；更重要的是，在RA抑制MCF-7细胞增殖中，QKI-5对FoxO1的这种负性调控能够抑制细胞衰老，从而有利于RA更好地发挥调节细胞周期阻滞，诱导分化或凋亡的功能。维甲酸(All-trans-retinoic acid ，ATRA)是一种经典的分化和凋亡诱导剂。 在体外一些髓样细胞系中ATRA 可以诱导细胞周期阻滞及启动终末分化。并且由于它的这一特性已在临床用于治疗急性早幼粒细胞性白血病，并取得很好的疗效。除了造血系统，RA对许多实体瘤细胞系也具有诱导分化的功能。 尽管研究人员对RA 的许多生物学功能了解地非常清楚，但是关于它发挥作用的分子机制却知道的非常有限。我们的前期实验通过基于PCR的消减杂交方法从ATRA诱导人早幼粒白血病HL-60细胞分化过程中，克隆了一系列新基因，Apr3是其中之一。我们首先通过InterPro和PROSITE这两个蛋白质分析软件对Apr3进行了功能结构域的预测，发现Apr3在其氨基端含有一段信号肽序列，之后紧跟一个EGF domain，在其羧基端分别为跨膜区及氨基酸系列非常短的胞内区，提示Apr3可能是一个膜蛋白。 Apr3是ATRA诱导HL-60细胞分化时差异表达的一个新基因，它是否存在于其他实体瘤呢？RT-PCR 分析显示Apr3在多种细胞中有广泛的分布，并且绝大多数细胞经ATRA诱导后，Apr3的表达都有不同程度的升高。通过间接免疫荧光对Apr3的亚细胞定位进行研究发现Apr3沿细胞膜分布，是一个膜蛋白；然而缺失跨膜区及胞内区的截短体Apr3在细胞浆内呈颗粒样、点状分布，具备分泌蛋白的典型特征。 RA作为分化诱导剂，它可以抑制细胞的增殖，同时促进细胞的分化。相关的机理研究表明，ATRA可诱导细胞周期阻滞于G1期，Apr3是受到RA诱导表达的分子，它是否参与对细胞周期的调控是我们首先关注的内容。流式细胞仪检测发现Apr3能将细胞周期阻滞于G1/S期，而Apr3使S期细胞增多，提示它可以促进细胞的增殖。在细胞周期进程中，cyclin D1是发挥作用最关键的调节因子。为此通过荧光素酶报告系统观察Apr3是否影响cyclin D1启动子的活性，结果表明Apr3过表达能显著抑制cyclin D1的启动子活性，而Apr3则具有完全相反的作用，高度提示膜蛋白Apr3可能是调控细胞周期的关键分子。进一步检测细胞周期调控的关键分子cyclin D1的mRNA和蛋白水平，与报告系统结果一致。 本课题研究结果提示Apr3在多种肿瘤细胞中广泛表达，并且受到RA信号通路的上调。它分布在细胞膜表面，主要可能通过识别相关配体直接参与对细胞周期的调控，特别是通过抑制cyclin D1的表达，引起细胞周期的阻滞。 说明此分子在ATRA信号通路的重要作用。