雷帕霉素抑制内皮细胞增殖和迁移:PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信号通路的作用

摘要

研究背景：
　　冠状动脉介入治疗发展到今天，药物洗脱支架已经取得令人瞩目的效果。相对于金属裸支架治疗而言，药物洗脱支架在减少血管成形术后再狭窄方面有着不可比拟的优势。但随着其大规模的临床应用，药物洗脱支架术后支架内血栓又引起了人们的关注。与裸支架相比，药物洗脱支架降低了术后再狭窄率却没有改变甚至增加了支架内血栓的发生。尤其是晚期支架内血栓形成更加导致人们对药物洗脱支架应用的疑虑。
　　随着研究的不断深入，人们发现，支架内血栓形成与支架表面的内皮化程度密切相关，即内皮化越完全，支架内血栓发生的机率越低。实验中发现，祼支架术后28天内可完全内皮化，而药物洗脱支架在6个月时还显示内膜愈合不完全，表面有纤维蛋白沉积及炎症细胞附着，易发生支架内血栓。而多数研究认为，引起药物支架表面内皮化不完全的主要原因是支架表面的涂层药物。
　　雷帕霉素（西罗莫司）是一种大环内酯类免疫抑制剂。由于该药有免疫抑制、抗炎和抗细胞增殖作用，所以人们将其涂层于金属支架表面，通过支架植入后药物在病变部位的局部释放，抑制血管平滑肌细胞（Vascularsmoothmusclecells,VSMCs）的迁移和增殖，最终减少术后再狭窄率。雷帕霉素主要是与胞浆蛋白--FK506结合蛋白12（FKBP-12）结合形成FKBP12/雷帕霉素复合物，再与胞内特定的细胞周期调节蛋白--哺乳动物雷帕霉素靶分子（Mammaliantargetofrapamycin,mTOR）结合，并抑制其活性，从而干预多个G1期向S期过渡的周期调控蛋白，最终诱导细胞周期停滞于G1期的晚期。鉴于细胞普遍表达细胞周期调控蛋白，可以想象，雷帕霉素不但影响VSMCs的增殖和迁移，同样影响内皮细胞的增殖和迁移及内皮祖细胞在局部的定位及附着，而这两种细胞对内皮修复是至关重要。这也可能是药物洗脱支架术后，支架表面内皮化延迟的原因。
　　研究目的：
　　1.动物在体实验观察植入祼金属支架和药物洗脱支架28天后，局部血管段内皮愈合和血小板黏附情况。
　　2.体外细胞实验观察雷帕霉素对内皮细胞增殖和迁移的影响；对内皮祖细胞凋亡的影响。同时在体实验观察雷帕霉素对循环中VEGF表达的影响。
　　3.研究PI3K/Akt及mTOR/p70S6K信号通路是否参与雷帕霉素对内皮细胞增殖和迁移的抑制作用，并明确PI3K/Akt与mTOR/p70S6K信号蛋白在其中的作用和两者的相互关系。
　　实验方法：
　　1.六只18-22kg雄性杂种犬在左胸廓内动脉远端及近端分别植入Cypher雷帕霉素药物洗脱支架和Bxsonic裸金属支架。术前及术后给予双联抗血小板治疗；术后1个月，处死杂种犬，解剖离取支架植入处血管段并固定；纵切后电镜扫描观察支架表面血管覆盖情况及是否有血小板黏附或微血栓形成。
　　2.原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞及内皮祖细胞，加入不同浓度的雷帕霉素（0.1、1、10和100ng/ml）或等体积的10％甲醇孵育24、48或72小时。MTT法检测内皮细胞及内皮祖细胞增殖；划痕法及Tranwell小室法观察内皮细胞迁移；流式细胞术检查内皮细胞及内皮祖细胞凋亡。
　　3.SD雄性大鼠（100-150g）给予雷帕霉素（0.05、0.10、0.15和0.20mg/kg/d）或者10％甲醇（0.1ml/kg/d）连续腹腔注射5天，尾静脉采血，ELISA法检测大鼠血循环中VEGF水平。
　　4.雷帕霉素(10ng/ml)孵育微血管内皮细胞24小时后，Westernblot法观察FKBP-12、mTOR及p70S6激酶磷酸化水平，并与用同等浓度甲醇孵育的对照组进行比较。
　　5.原代培养的微血管内皮细胞分组为：对照组；VEGF(20ng/ml)组；VEGF(20ng/ml)+Wortmannin(100nM)组及VEGF(20ng/ml)+LY294002(20μM)组。各组细胞培养24小时后，观察内皮细胞的增殖和迁移。同时Westernblot法检测mTOR和p70S激酶的表达水平和磷酸化水平。
　　6.原代培养的微血管内皮细胞分组为：对照组；VEGF(20ng/ml)组；VEGF(20ng/ml)+Wortmannin(100nM)；VEGF(20ng/ml)+LY294002(20μM)组；雷帕霉素(10ng/ml)组。各组内皮细胞培养4小时后，裂解细胞，Westernblot法观察Akt和p-Akt表达水平。
　　实验结果：
　　1.犬胸廓内动脉金属裸支架及药物支架植入30天后的电镜扫描发现：与金属裸支架相比，药物支架表面内皮化不完全；部分药物支架暴露于管腔；局部表面有血小板黏附形成。
　　2.孵育24小时后，10ng/ml及100ng/ml的雷帕霉素明显抑制内皮细胞增殖（71.5％±6.4％vs.Control,P<0.01；57.0％±9.0％vs.Control,P<0.001）；48小时后，1ng/ml的雷帕霉素也明显抑制内皮细胞增殖（55.3％±13.4％vs.Control，P<0.01）；0.1ng/ml组于72小时后明显抑制内皮细胞增殖（26.3％±11.9％vs.Control，P<0.01）。孵育24小时后，雷帕霉素明显抑制内皮细胞的迁移，1ng/ml组是对照组的75.5％±7.0％（P<0.05）；10ng/ml组是对照组的65.2％±4.3％（P<0.001）；而100ng/ml组是对照组的39.5％±8.0％（P<0.001）。和对照组相比，0.1、1、10和100ng/ml的雷帕霉素组中内皮祖细胞的增殖分别为98.7％±8.9％（P>0.05）、84.9％±6.7％（P<0.001）、77.2％±6.1％（P<0.001）及69.0％±4.1％（P<0.001）。雷帕霉素也诱导内皮祖细胞的凋亡，正常内皮祖细胞组的凋亡率为4.2‰±0.5‰，而1、10和100ng/ml的雷帕霉素组中，内皮祖细胞的凋亡率分别为：10.8‰±0.8‰、14.4‰±1.0‰及18.6‰±1.2‰（P<0.001）。
　　3.SD大鼠腹腔给药5天后与对照组相比，高浓度的雷帕霉素（0.15和0.2mg/kg/d）明显抑制循环中VEGF的表达（P<0.05及P<0.01），但较低浓度的雷帕霉素（0.05和0.10mg/kg/d）没有抑制作用。
　　4.Westernblot法分析见雷帕霉素(10ng/ml)孵育24小时后抑制内皮细胞中mTOR的磷酸化水平，但FKBP-12磷酸化水平未有改变，而且内皮细胞中p70S6激酶的磷酸化也被雷帕霉素抑制。
　　5.VEGF作用4小时后，内皮细胞中mTOR和p70S6K蛋白磷酸化水平明显增加，但PI3K/Akt的特异性抑制剂Wortmannin或LY294002可完全阻断VEGF的这一作用。
　　6.VEGF明显促进内皮细胞迁移（188.0％±5.5％vs.对照组,P<0.001）；而VEGF+LY294002或者VEGF+Wortmannin组与对照组比较，内皮细胞的迁移无差别（89.3％±11.3％及83.7％±6.8％vs.对照组,P>0.05）。同样观察到VEGF明显促进内皮细胞增殖（175.7％±8.9％vs.对照组,P<0.001）；而VEGF+LY294002或者VEGF+Wortmannin组与对照组比较则无变化（82.8％±10.9％及99.0％±5.9％vs.对照组,P>0.05）。
　　7.Wortmannin和LY294002都可抑制内皮细胞中Akt蛋白的磷酸化。但雷帕霉素孵育4小时后，Akt的磷酸化水平增高。
　　结论：
　　1.雷帕霉素洗脱支架植入术后28天，支架表面内皮化不完全。其原因可能为雷帕霉素抑制内皮细胞的增殖和迁移、诱导内皮祖细胞的凋亡、并且减少局部血管中VEGF的表达，从而延缓药物洗脱支架后再内皮化进程。
　　2.雷帕霉素通过抑制mTOR/p70S6K蛋白的激活进而抑制内皮细胞的增殖和迁移；PI3K/Akt信号蛋白是激活mTOR/p70S6K蛋白所必需的，并且是上游信号蛋白。
　　3.PI3K/Akt信号蛋白和mTOR/p70S6K信号蛋白并非是单纯的线性关系，在雷帕霉素抑制mTOR/p70S6K蛋白的过程中，PI3K和mTOR之间存在反馈调节，Akt可能是反馈调节的中间分子。

目录

封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

1. 冠状动脉狭窄的介入治疗

2. 内皮细胞功能

3. 动脉内皮损伤后反应

4. 雷帕霉素对细胞增殖和迁移的影响

5. 结语

正 文

第一部分 雷帕霉素对支架植入术后血管再内皮化的影响：抑制内皮细胞增殖和迁移及诱导内皮祖细胞凋亡

1、材料与方法

2 结果

3. 讨论

第二部分 PI3K/Akt 参与雷帕霉素/mTOR/P70S6K 信号通路对内皮细胞增殖和迁移的抑制

1、材料与方法

2. 结果

3.讨论

小 结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢