Cacna1f基因突变对大鼠神经肌肉功能影响的研究

摘要

先天性静止性夜盲（congenitalstationarynightblindness,CSNB）是一种遗传性视网膜疾病，表现为视网膜杆体细胞的功能异常，视网膜电图（electroretinogram,ERG）b波降低或消失，暗适应功能丧失或较差，但是通常不伴有进行性的眼底改变，以及病人不会感觉到自己的运动能力下降。而有些运动系统疾病却伴有CSNB疾病表型，如肌营养不良症可以伴有视觉系统异常。其中Duchenne肌营养不良症（Duchennemusculardystrophy，DMD）具有与CSNB病相似的ERG波形改变，但是没有检索到CSNB疾病与DMD疾病有关联的报道[1，2]。我们发现并正在建立近交系的一种不完全型CSNB（CSNB2）模式大鼠[3，4]，致病基因为Cacna1f，遗传模式为伴性遗传[5]；该品系大鼠除视觉症状外，前期实验中还发现该品系大鼠运动能力可能也存在异常，如爬杆实验、旋转棒实验中均表现为耐力不良（易疲劳）。Cacna1f基因突变使传递神经递质的活动区（activezone，CAZ）的ribbon小体等结构发生改变（前期实验），还能使突触相关蛋白表达下降，从而阻滞视觉信号从光感受细胞向二级神经元传递，这可能是导致视觉表型的重要机制之一。骨骼肌神经肌接头处存在传递神经递质的CAZ，并且也有功能类似于ribbon小体的结构--致密体以及突触相关蛋白。最初认为Cacna1f基因只在视网膜内表达，目前认为Cacna1f所编码的钙通道蛋白也存在于骨骼肌等其它组织中[6，7]。鉴于CSNB大鼠存在骨骼肌运动耐力不良表型，因此我们推测：Cacna1f基因突变也会影响到骨骼肌-神经肌接头处的神经递质释放活性区，使神经递质释放受阻信号传导阻滞，故导致神经肌肉功能的改变。为验证该推测，本文从以下四个方面进行研究：1、Cacna1f突变大鼠视网膜结构及功能发育变化的特点；2、CSNB大鼠肌耐力不良遗传特征的验证；3、Cacna1f突变对大鼠骨骼肌功能变化特征的影响；4、Cacna1f突变大鼠骨骼肌中突触相关蛋白表达的特征。
　　材料与方法
　　利用本实验室发现并培育的CSNB近交系大鼠及同龄野生型SD大鼠，采用视觉电生理检查技术，观察CSNB大鼠视网膜发育各时期的视觉功能变化；通过CSNB大鼠与对照组大鼠杂交，建立F1代杂交鼠，验证肌肉耐力不良的遗传特征；运用离体比目鱼肌肌条灌流技术，检测CSNB大鼠骨骼肌的收缩功能是否发生改变；利用免疫组化技术，了解CSNB大鼠突触蛋白及视细胞的发育情况，以及骨骼肌、脊髓、大脑上钙通道蛋白的表达特征，并通过激光共聚焦技术对蛋白表达量进行观察；通过免疫印迹技术，半定量CSNB大鼠突触相关蛋白在骨骼肌的表达特征。
　　结果
　　1、不同时期CSNB大鼠视网膜结构及功能的发育特点
　　在睁眼前1天、睁眼当天，野生型大鼠与CSNB大鼠ERG明适、暗适反应较相似。野生型大鼠睁眼后2天，视杆反应（rodERG）出现,最大混合反应（MaxERG）出现b波，出现明适反应（PhotopicERG），OPs子波潜时较前期缩短、幅值增大；2天后波形变化不大，仅各项波形幅值增大、潜时延长。CSNB大鼠ERG波形与睁眼前波形一直较相似；出生后第26天（Postnatal26，P26）CSNB大鼠PhotopicERG明显。两组大鼠的Flicker反应在睁眼前似存在。
　　大鼠睁眼前后视觉功能发育曲线显示：从睁眼前一天到P26，野生型大鼠与CSNB大鼠MaxERG的a波幅值无明显差异，但CSNB大鼠潜伏期均延长（P<0.05）。野生型大鼠PhotopicERG较CSNB大鼠幅值高、潜时短（P<0.01）均有统计学意义。视觉功能衰退曲线表明：野生型大鼠MaxERG的a波以及PhotopicERG的b波3个月幅值达最大，17个月仍能记录。CSNB大鼠MaxERG的a波21天至1月幅值最大，到13个月a波消失；PhotopicERG的b波P21出现，1月幅值最大，10个月波形消失。
　　HE染色显示，两种大鼠视网膜形态结构的发育较相似。在睁眼时两种大鼠的视网膜CAZ内的突触相关蛋白SYN与CtBP2，未见明确点状表达，睁眼后各时期CSNB大鼠的两种蛋白表达均较野生型大鼠减少；SYN与CtBP2两者相互伴行，且表达量随视网膜早期发育而增加。两种大鼠的视杆双极细胞数量相似；睁眼时两种大鼠视杆双极细胞突触数量相似；睁眼后2天，野生型大鼠视杆双极细胞突触开始较CSNB大鼠增多。
　　2、CSNB大鼠肌耐力不良的遗传特征
　　经行为学及视觉电生理技术的检测，在杂交F1代子鼠中，所有雌鼠ERG表现均为正常，而雄鼠ERG表现均为CSNB表型；F1代雄鼠均表现为肌肉耐力不良，爬杆持续时间较雌鼠显著缩短（P<0.01）。提示CSNB大鼠肌肉耐力不良伴随着CSNB疾病视觉表型，为性连锁隐性遗传特征。
　　3、Cacna1f突变大鼠肌肉收缩功能的变化特征
　　野生型大鼠与CSNB大鼠比目鱼肌（soleus,SOL）的最适频率相似，约为100Hz。间断强直收缩刺激条件下0.8％DC（DutyCycle）以及30％DC的Pmin/Pmax值两组间未见统计学差异。完全强直收缩刺激条件下，CSNB大鼠收缩曲线到达峰值张力时程（timetopeaktension，TPT）提前；但P30/P0比值两种大鼠间未见显著性差异。
　　4、Cacna1f突变大鼠各组织中钙通道蛋白的表达特征及骨骼肌中突出相关蛋白表达特征
　　视网膜中，野生型大鼠与CSNB大鼠标记Cav1.4钙通道蛋白N端的抗体，在外网状层（outerplexilayer,OPL）、外界膜（outersegment,OS）、节细胞层（gamglioncelllayer,GCL）均有表达，但在CSNB大鼠视网膜表达较弱；Cav1.4钙通道蛋白C端的抗体在CSNB视网膜上表达不明确。SYN在野生型大鼠视网膜的OPL中表达，而CSNB大鼠的这种点状表达较少。骨骼肌中，SYN与Cav1.4钙通道蛋白N端抗体染色，在CSNB大鼠骨骼肌表达较在野生型大鼠减少；Cav1.4钙通道蛋白C端染色在CSNB大鼠骨骼肌中表达不明确。通过WesternBlot技术，SYN在野生型大鼠及CSNB大鼠SOL骨骼肌中表达都呈现出两个条带；分子量较大的SYN蛋白在CSNB大鼠表达较野生型大鼠明显下降，表达量约为对照组的三分之一（P<0.05）；小分子量SYN两种大鼠间差异不大；EDL中SYN表达不明确。脊髓灰质背根中Cav1.4在CSNB大鼠表达较野生型大鼠下降，两组大鼠钙通道蛋白在大脑均未见表达。
　　结论
　　1.从睁眼后2天开始野生型大鼠与CSNB大鼠ERG差别增大，此前两者ERG表型相似。CSNB大鼠视觉发育最佳时期约在1月，13个月视觉完全衰退。CSNB大鼠视杆双极细胞树突发育进程异常；CSNB大鼠CAZ上突触相关蛋白表达下降，从而影响CAZ的功能。
　　2.证实CSNB大鼠杂交系F1代大鼠骨骼肌功能异常伴随CSNB疾病的ERG表型，为X连锁隐形遗传表型。
　　3.CSNB大鼠低频间断强直收缩功能未见改变，高频完全强直收缩功能改变；Cacna1f突变仅引起骨骼肌细胞膜功能的轻微异常。
　　4.Cacna1f突变确实引起CSNB大鼠骨骼肌上Cav1.4的异常表达，及影响慢肌CAZ上突触相关蛋白SYN的表达。以上结论初步验证了我们的假设：Cacna1f突变影响到骨骼肌NMJ的CAZ功能，从而导致突触信号传导阻滞，骨骼肌耐力下降；CAZ的功能改变导致视网膜及骨骼肌多系统功能发生变化。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、视网膜的发育

二. 突触CAZ区的概述

三．Cacna1f 基因的概述

四．一些运动系统疾病伴有Cacna1f基因突变表型

五．神经肌肉功能异常---骨骼肌肌力变化的原因

六．小结

正文

Cacna1f 基因突变对大鼠神经肌肉功能影响的研究Effect of Cacna1f mutation on neuromuscular function in rat

第一部分 Cacna1f 突变对不同时期 CSNB 大鼠视网膜结构及功能的影响

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 验证 CSNB 大鼠肌耐力不良的遗传特征

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分 Cacna1f 突变大鼠肌肉收缩功能变化特征

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四部分 Cacna1f 突变大鼠骨骼肌中突触相关蛋白的表达特征

1 引言

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢