携载基质金属蛋白酶小干扰RNA壳聚糖纳米微球防止体外培养的软骨细胞退变的研究

摘要

背景：
　　软骨组织工程中，体外扩增的软骨细胞极易发生去分化，表现为细胞表型消失，合成细胞外基质能力下降。基质金属蛋白酶（matrix metallo-proteinase,MMP）是一组广泛存在于各种组织、可降解细胞外基质的蛋白酶，与软骨细胞去分化、软骨退变关系密切。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指将与靶基因同源序列的双链RNA导入细胞，在细胞内与靶基因的信使RNA（messenger RNA,mRNA）结合并迅速将其降解，从而抑制该基因表达。壳聚糖(chitosan,CS)是一种带正电荷的大分子，在一定条件下可与带负电荷的核酸结合，形成纳米级别的聚合物可被细胞胞吞。本研究拟使用携载MMP-3和13的小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）质粒的壳聚糖纳米微粒转染体外培养的种子细胞，试图抑制去分化相关基因表达，培养出表型优良、稳定的软骨细胞，防止再生软骨细胞退变。
　　实验一:软骨细胞的体外培养与鉴定
　　目的：通过体外培养兔关节软骨细胞，观察软骨细胞的形态、体外培养时维持细胞表型的能力，选出最适合作软骨组织工程的种子细胞。方法：利用贯序酶消化法分离兔关节软骨，体外培养，并利用组织学和免疫细胞化学等方法鉴定、评价软骨细胞功能。结果：利用胰酶-胶原酶贯序消化法，可成功消化兔关节软骨细胞，并成功培养。用HE、甲苯胺蓝、番红-O等组织学染色方法予以鉴定，Ⅰ、Ⅱ型胶原免疫细胞化学法观察软骨细胞功能。结论：通过体外培养，原代至第3代的软骨细胞维持表型的能力无明显差异，适合做组织工程的种子细胞，第4代以后发生去分化、分泌Ⅱ型胶原的能力显著减低。
　　实验二:携载质粒的纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞
　　目的：研究携载质粒的不同分子量的壳聚糖纳米微球的包裹率和保护DNA的能力，镜下观察其大小和形态，观察其对原代兔关节软骨细胞的转染效率。方法：用分子量在5K到800K之间的六种壳聚糖，利用表达增强型绿色荧光蛋白质粒(plasmid Enhanced Green Florescence Protein,pEGFP)作报告基因，通过复合凝聚法制备壳聚糖-质粒纳米微球。观察壳聚糖纳米微球介导pEGFP在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达情况；并计算转染效率。结果：分子量为170K、250K和800K的壳聚糖纳米微球的转染效率均高于5K、50K和85K的壳聚糖纳米微球，其中800K的壳聚糖纳米微球与脂质体相当。结论：与脂质体转染组相比，氮/磷（Nitrogen/Phosphate,N/P）比值为5时，相对分子量为800k的壳聚糖纳米微球可高效转染原代培养的兔软骨细胞，可作为今后进一步体外、体内实验的首选转染载体。
　　实验三:携载MMP3、13-shRNA的壳聚糖纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞
　　目的：通过利用携载MMP3、13-shRNA的壳聚糖纳米微球体外转染原代兔关节软骨细胞，利用实时定量聚合酶链式反应（real-time quantitative Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）检测基因干扰效果，并与阴性对照组比较。方法：利用分子量800K的壳聚糖制作携载MMP3、13的shRNA的壳聚糖纳米微球，N/P比值为5，体外转染原代培养的兔关节软骨细胞，设立随即核酸序列作为阴性对照。利用qRT-PCR检测干扰效率。结果：携载MMP-3和13基因的siRNA质粒的壳聚糖纳米微球能成功转染兔关节软骨细胞，其干扰MMP表达的效率均可达20％左右，并显著高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：携载MMP的siRNA质粒的壳聚糖纳米微球能成功转染，并有效干扰MMP-3和13表达mRNA，可用于进一步体内试验。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文 献 回 顾

1 软骨组织与软骨组织工程

2 软骨细胞退变与 MMP 之间的关系

3 RNAi 技术及其在基因治疗中的应用

4 壳聚糖纳米微球作为转染载体转染软骨细胞的相关研究

5 携载 MMP 的 siRNA 质粒的纳米微球转染软骨细胞的展望

正文

实验一 软骨细胞的体外培养与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 壳聚糖携载质粒纳米微球体外转染兔关节软骨细胞的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 携载 MMP 的 siRNA 的壳聚糖纳米微球转染体外培养的兔关节软骨细胞

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢