一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法

摘要

本发明公开了一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法，属于血管支架的技术领域。本发明包括支架本体，支架本体的外表面设有纳米涂层，纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层；本发明还提供上述血管支架的制备方法，包括构建组织因子siRNA、制备携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米颗粒、裸金属血管支架表面碱化处理和制备羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。本发明运用纳米技术将羟丁基壳聚糖制成纳米颗粒复合物，并将携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米复合物附着在血管支架上，通过释放组织因子沉默RNA基因，抑制平滑肌细胞过度增生，防止支架内血栓和再狭窄。

说明书

技术领域

本发明属于血管支架的技术领域，特别是指一种羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层血管支架及其制备方法。

背景技术

冠状动脉支架置入术后，刺激血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖和迁移，激发体内局部组织因子表达明显增高，使体内呈高血栓负荷状态，极易形成支架内血栓及支架内再狭窄。对于血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖可以利用局部直接给药策略，比如药物洗脱支架（DES），来降低再狭窄的发生率。与此同时，血管内皮细胞受到不同程度的抑制，在此期间，平滑肌细胞（SMC）极易过度增殖、迁移，并释放组织因子，引起血小板聚集形成支架内血栓。最近的研究表明，药物洗脱支架（DES）的置入也可能刺激组织因子（TF）的表达，从而促进体内动脉血栓的形成。TF参与复杂的机制包括细胞内信号转导，通过调节VSMC迁移、增殖，进而引发血栓形成和血管壁重构。因此，干预血管组织因子的过度增殖是非常有意义的。

基因载体的选择是基因治疗中的一个关键因素。病毒载体虽有较高的转导效率，但它存在致突变或癌变的潜能，对宿主免疫原性及生产成本高等问题，大大限制了它们的应用。脂质体具有良好的脂质生物相容性，然而，不借助于转染试剂，并不能保证高效的细胞摄取和基因沉默效应，并且阳离子脂质体具有细胞膜活性，可能对细胞产生一定的破坏作用等问题，限制了它在体内的应用。非病毒载体是目前研究的重点，壳聚糖作为药物递送载体、生物涂层和DNA和siRNA等基因转染材料的广泛研究，具有生物相容性、生物可降解、抑菌活性、药物缓释控释能力和无毒性聚合物等优点。但是，其同时也存在转染效率相对较低、水溶性差、靶向性不好的缺点。

发明内容

本发明提供一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架及其制备方法，解决了现有技术中血管支架极易形成支架内血栓、再狭窄及其涂层载体存在转染效率低、水溶性差和靶向性不好的问题。

本发明的一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：对TF-mRNA167-186bp序列，序列为5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3，标记上荧光素，得TF-siRNA组织因子；

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）取羟丁基壳聚糖片层状样品，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50-80min后，溶于乙酸溶液，过滤除菌，得羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到步骤（b）所得TPP水溶液中，搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40-50滴/min，继续搅拌，室温孵育15-60min，分装，避光保存，得羟丁基壳聚糖纳米复合物；

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，并真空干燥20-40min；然后，将其置入碱性溶液中，浸泡处理，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗，真空干燥20-40min；

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，调节溶液的pH值为3.4-6.4，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，于30-60℃和电流强度为0.5-2mA/cm²下，电沉积30-120min，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

优选地，所述步骤（4）中，采用氢氧化钠调节羟丁基壳聚糖纳米复合物的pH值；阴极和阳极两个电极的距离为5-20mm，电位低压为-2-0V；电沉积完毕之后，在空气中采用自然晾干的方法进行干燥。

优选地，所述步骤（2）中，步骤（d）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，羟丁基壳聚糖的浓度为714.5ug/mL，siRNA的浓度为1.13umol/L；步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，羟丁基壳聚糖的浓度为0.5-2mg/mL，所用乙酸的浓度为0.2M，其pH值为5.5；步骤（b）所得TPP水溶液中，TPP的浓度为0.25-1.0mg/mL，采用0.22um的滤膜进行过滤除菌；步骤（c）所得siRNA溶液中，siRNA的浓度为10-30umol/L。

优选地，所述步骤（3）中，超声时间为30-60min，碱性溶液的浓度为3-5M，浸泡时间为24-72h，浸泡温度为40-70℃，碱性溶液为氢氧化钠水溶液。

进一步优选地，所述步骤（1）中，荧光素为FAM荧光。

本发明的一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架，其主要是通过以下技术方案加以实现的：包括支架本体；所述支架本体的外表面设有纳米涂层，所述纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。

本发明的有益效果是：

（1）、本发明采用强碱处理金属血管支架，会在其表面产生微孔和-OH基团，该微孔和-OH基团能储存药物，并有利于紧密结合羟丁基壳聚糖（HBCS:TF-siRNA）纳米颗粒复合物，有利于药物缓慢释放。

（2）、本发明中羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA可以抑制组织因子表达，同时可以干预血管平滑肌细胞增殖且能显著诱导细胞凋亡，对支架内再狭窄的起始因素实现一靶多效，即可治疗细胞增殖疾病，同时又可缓解高血栓负荷状态，为冠状动脉支架植入术后再狭窄的防治提供了新的思路和方向。

（3）、本发明使用壳聚糖衍生物，即羟丁基壳聚糖，由于羟丁基基团的高亲水性，羟丁基壳聚糖获得一个在生理的pH范围可以完全溶解的特性，同时仍然保留其母体壳聚糖的良好的生物活性。所得羟丁基壳聚糖运载系统满足了非毒性载体的各种参数。本发明通过构建组织因子siRNA、制备携载组织因子siRNA的羟丁基壳聚糖纳米复合物、裸金属血管支架表面碱化处理和制备羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层而制得。该技术是纳米载药技术与基因靶向治疗在支架表面涂层材料的最新研究成果，羟丁基壳聚糖组织因子siRNA通过缓慢控制释放组织因子，具有抑制平滑肌细胞过度增生，防止支架内血栓和再狭窄。

（4）、本发明采用TPP（三聚磷酸钠）作为离子交联，保证了一个很好的包封的效率；高分子量的壳聚糖和较高的脱乙酰度能够浓缩siRNA为分散的纳米颗粒，对复合物的稳定和促进细胞吸收是有必要的。

（5）、本发明采用壳聚糖衍生物纳米载体运用电化学沉积技术携载组织因子siRNA制备新型涂层血管支架，该血管支架可以从基因水平抑制平滑肌细胞增生，从而根源上解决了目前支架内再狭窄的问题。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明一些实施例的部分附图，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所得HBCS:TF-siRNA纳米复合物的TEM图片；

图2为本发明所得HBCS:TF-siRNA纳米复合物的粒径分布图；

图3为本发明所得HBCS:TF-siRNA在转染后24h的细胞内定位图片；

图4为静息细胞和PDGF-BB刺激细胞转染后不同时间下上清液中TF浓度的测定结果图；

图5为CCK-8分析HBCS:TF-siRNA在不同的时间段对细胞活性的影响图；

图6为AO/EB染色的HUVSMC使用荧光显微镜放大200倍的图片；

图7为细胞转染72h后HUVSMC的凋亡率结果分析图；

图8为本发明的血管支架和裸金属支架的在体试验对比图片；

图中：A-空白组；B-实验组；C-阴性对照组；D-未刺激组；E-裸金属支架组；F-本发明支架组；t₁-24h；t₂-48h；L-活细胞；M-凋亡细胞；N-坏死细胞。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：对TF-mRNA167-186bp序列，序列为5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3，标记上荧光素，得TF-siRNA组织因子；

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）取羟丁基壳聚糖片层状样品，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50-80min后，溶于乙酸溶液，过滤除菌，得羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取三聚磷酸钠（TPP），添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC（焦碳酸二乙酯）水中，溶解，得siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到步骤（b）所得TPP水溶液中，搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40-50滴/min，继续搅拌，室温孵育15-60min，分装，避光保存，得羟丁基壳聚糖（HBCS:TF-siRNA）纳米复合物；

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，并真空干燥20-40min；然后，将其置入碱性溶液中，浸泡处理，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗，真空干燥20-40min；

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，调节溶液的pH值为3.4-6.4，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，于30-60℃和电流强度为0.5-2mA/cm²下，电沉积30-120min，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

进一步地，所述步骤（4）中，采用氢氧化钠调节羟丁基壳聚糖纳米溶液的pH值；阴极和阳极两个电极的距离为5-20mm，电位低压为-2-0V；电沉积完毕之后，在空气中采用自然晾干的方法进行干燥。

进一步地，所述步骤（2）中，步骤（d）所得羟丁基壳聚糖纳米复合物中，羟丁基壳聚糖的浓度为714.5ug/mL，siRNA浓度为1.13umol/L；步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，羟丁基壳聚糖的浓度为0.5-2mg/mL，所用乙酸的浓度为0.2M，其pH值为5.5；步骤（b）所得TPP水溶液中，TPP的浓度为0.25-1.0mg/mL，采用0.22um的滤膜进行过滤除菌；步骤（c）所得siRNA溶液中，siRNA的浓度为10-30umol/L。

进一步地，所述步骤（3）中，超声时间为30-60min，碱性溶液的浓度为3-5M，浸泡时间为24-72h，碱性溶液为氢氧化钠水溶液。

更进一步地，所述步骤（1）中，荧光素为FAM荧光。

本发明的一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架，包括支架本体；所述支架本体的外表面设有纳米涂层，所述纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。

实施例一

一种羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层血管支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：首先在NCBI里寻找凝血因子III（TF）的mRNA序列全长2104bp（M16553.1，GI:339503）；本实验中筛选的TF-siRNA靶序列，选取针对TF-mRNA167-186bp序列（5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3），交由公司设计其沉默序列，并标记上FAM荧光，得TF-siRNA组织因子。

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）准确称取干燥的羟丁基壳聚糖片层状样品3mg，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射60min后，溶于3mL乙酸溶液（乙酸浓度为0.2M，pH值为5.5），采用0.22um滤膜过滤除菌，得浓度为1mg/mL的羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，用0.22um滤膜过滤除菌，得浓度为0.5mg/mL的TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得浓度为23.68umol/L的siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到0.1mL的步骤（b）所得TPP水溶液中，磁力搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到3mL的步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40滴/min，继续磁力搅拌，室温孵育30min，分装，避光保存，得包封型羟丁基壳聚糖纳米复合物；该复合物中，羟丁基壳聚糖的浓度为714.5ug/mL，siRNA浓度为1.13umol/L。

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，超声时间均为30min，去除表面残垢，然后，真空干燥30min；最后，将其置入5M的氢氧化钠碱性溶液中，于60℃下浸泡处理24h，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗30min，并真空干燥30min。

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，采用氢氧化钠调节溶液的pH值为4.4，在电解槽中，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电流阴极电沉积模式，采用三电极系统，于40℃和1mA/cm²的电流强度下，电沉积60min；其中，阴极和阳极两个电极的距离为10mm，电位低压为-2V；然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

上述步骤所得羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架，包括支架本体；支架本体的外表面设有纳米涂层，纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。

实施例二

一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：首先在NCBI里寻找凝血因子III（TF）的mRNA序列全长2104bp（M16553.1，GI:339503）；本实验中筛选的TF-siRNA靶序列，选取针对TF-mRNA167-186bp序列（5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3），交由公司设计其沉默序列，并标记上荧光素，得TF-siRNA组织因子。

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）准确称取干燥的羟丁基壳聚糖片层状样品1.5mg，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射50min后，溶于3mL乙酸溶液（乙酸浓度为0.2M，pH值为5.5），过滤除菌，得浓度为0.5mg/mL的羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得浓度为0.25mg/mL的TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得浓度为10umol/L的siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到0.1mL的步骤（b）所得TPP水溶液中，磁力搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到3mL的步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度50滴/min，继续磁力搅拌，室温孵育15min，分装，避光保存，得包封型羟丁基壳聚糖纳米复合物。

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，超声时间均为60min，去除表面残垢，然后，真空干燥20min；最后，将其置入3M的氢氧化钠碱性溶液中，于70℃下浸泡处理48h，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗60min，并真空干燥40min。

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，采用氢氧化钠调节溶液的pH值为3.4，在电解槽中，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电流阴极电沉积模式，采用三电极系统，于30℃和0.5mA/cm²的电流强度下，电沉积30min；其中，阴极和阳极两个电极的距离为5mm，电位低压为-1V；然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并在空气中采用晾干的方法进行干燥，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

上述步骤所得羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架，包括支架本体；支架本体的外表面设有纳米涂层，纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。

实施例三

一种壳聚糖携载siRNA涂层血管支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：首先在NCBI里寻找凝血因子III（TF）的mRNA序列全长2104bp（M16553.1，GI:339503）；本实验中筛选的TF-siRNA靶序列，选取针对TF-mRNA167-186bp序列（5-GCGCTTCAGGCACTACAAAT-3），交由公司设计其沉默序列，并标记上FAM荧光，得TF-siRNA组织因子。

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）准确称取干燥的羟丁基壳聚糖片层状样品6mg，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射80min后，溶于3mL乙酸溶液（乙酸浓度为0.2M，pH值为5.5），采用0.22um滤膜过滤除菌，得浓度为2mg/mL的羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，过滤除菌，得浓度为1.0mg/mL的TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得浓度为30umol/L的siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到0.4mL的步骤（b）所得TPP水溶液中，磁力搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到3mL的步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度45滴/min，继续磁力搅拌，室温孵育60min，分装，避光保存，得包封型羟丁基壳聚糖纳米复合物。

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，超声时间均为40min，去除表面残垢，然后，真空干燥40min；最后，将其置入3.5M的氢氧化钠碱性溶液中，于40℃下浸泡处理72h，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗40min，并真空干燥20min。

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，采用氢氧化钠调节溶液的pH值为5.4，在电解槽中，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电流阴极电沉积模式，采用三电极系统，于50℃和1.5mA/cm²的电流强度下，电沉积90min；其中，阴极和阳极两个电极的距离为20mm，电位低压为0V；然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并在空气中采用晾干的方法进行干燥，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并在空气中干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

上述步骤所得羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架，包括支架本体；支架本体的外表面设有纳米涂层，纳米涂层为羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA的纳米涂层。

对比实施例一

一种羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层血管支架的制备方法，包括以下步骤：

（1）构建TF-siRNA靶序列：首先在NCBI里寻找凝血因子III（TF）的mRNA序列全长2104bp（M16553.1，GI:339503）；本实验中对TF设计阴性对照序列（5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3，5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3），得TF-siRNA组织因子。

（2）羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA纳米颗粒的制备：

（a）准确称取干燥的羟丁基壳聚糖片层状样品3mg，用洁净的镊子撕成薄片，平铺玻璃培养皿中，置于紫外灯下正反面各照射60min后，溶于3mL乙酸溶液（乙酸浓度为0.2M，pH值为5.5），采用0.22um滤膜过滤除菌，得浓度为1mg/mL的羟丁基壳聚糖乙酸溶液；

（b）取TPP，添加水溶解，搅拌均匀，采用0.22um滤膜过滤除菌，得浓度为0.5mg/mL的TPP水溶液；

（c）取步骤（1）所得TF-siRNA组织因子添加到DEPC水中，溶解，得浓度为23.68umol/L的siRNA溶液；

（d）将步骤（c）所得siRNA溶液加入到0.2mL的步骤（b）所得TPP水溶液中，磁力搅拌混匀，然后，将其缓慢滴加到3mL的步骤（a）所得羟丁基壳聚糖乙酸溶液中，滴加速度40滴/min，继续磁力搅拌，室温孵育30min，分装，避光保存，得包封型羟丁基壳聚糖纳米复合物；该复合物中，羟丁基壳聚糖的浓度为714.5ug/mL，siRNA浓度为1.13umol/L。

（3）支架表面碱化：将裸金属血管支架依次于丙酮、无水乙醇和去离子水中超声清洗，超声时间均为30min，去除表面残垢，然后，真空干燥30min；最后，将其置入5M的氢氧化钠碱性溶液中，于60℃下浸泡处理24h，取出后用双蒸水冲洗3次以上，再放入双蒸水中超声清洗30min，并真空干燥30min。

（4）羟丁基壳聚糖纳米粒支架涂层的制备：将步骤（3）中所得血管支架浸入步骤（2）所得羟丁基壳聚糖纳米溶液中，采用氢氧化钠调节溶液的pH值为4.4，在电解槽中，以血管支架为阴极、铂电极为阳极、饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电流阴极电沉积模式，采用三电极系统，于40℃和1mA/cm²的电流强度下，电沉积60min；其中，阴极和阳极两个电极的距离为10mm，电位低压为-2V；然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并在空气中采用晾干的方法进行干燥，然后，采用蒸馏水清洗血管支架，并在空气中干燥，得到羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层的金属支架。

将本发明实施例一至实施例三所得羟丁基壳聚糖携载组织因子（HBCS:TF-siRNA）纳米颗粒复合物（以下简称为实验组）及其制备的血管支架进行相关参数和性能测定，并与对比实施例一所得阴性对照样（以下简称为阴性对照组）以及空白试验（以下简称为空白组）进行对比，试验结果如图1-图8所示。

将本发明的HBCS:TF-siRNA纳米颗粒进行TEM测试，从图1中可以看出，本发明所得HBCS:TF-siRNA纳米颗粒的粒子表面光滑，围绕着较大的粒子有圆形的小颗粒共存。

将本发明的HBCS:TF-siRNA纳米颗粒在COULTERDELSA440sx型流体动力直径和分布仪上进行测量，从图2可以看出，本发明所得纳米复合物的颗粒大小约为397.59±47.83nm。

将本发明带负电荷FAM-labled的小干扰RNA（TF-siRNA）和带正电的羟丁基壳聚糖（HBCS）纳米粒通过静电吸引作用形成复合物（HBCS:TF-siRNA）；采用TPP作为交联剂，进一步稳定纳米颗粒的结构；通过Zeta电位试验发现，HBCS:TF-siRNA纳米颗粒的净正电荷显示+19.2±0.6mV。

将本发明的HBCS:TF-siRNA纳米颗粒通过紫外分光光度法进行测试，测试结果表明，HBCS:TF-siRNA纳米颗粒的载药率为93.4±0.7%。

将本发明的HBCS:TF-siRNA纳米颗粒在转染后24h的细胞内定位进行测试，由图3可以看出，与空白组和阴性对照组相比，本发明的HBCS:TF-siRNA在转染后24h的细胞内定位主要定位在细胞核周围，FAM标记的TF-siRNA的纳米复合物成功导入静脉血管平滑肌细胞（HUVSMC），转染效率在70%以上，实现了高转染效率。

将本发明的HBCS:TF-siRNA纳米颗粒进行静息细胞和PDGF-BB刺激细胞转染后24和48小时，测定上清液中TF的浓度，并由ELISA定量。从图4可以看出，实验组TF蛋白表现出明显的下降趋势；每个直条图代表平均值±标准差；n=12，#p<0.05，24h时与未刺激组相比；*p<0.05，48h未刺激组相比；**p<0.01，48h其他刺激组相比；48h后，实验组TF蛋白水平在34.2±1.8pg/ml，阴性对照TF蛋白水平在79.0±3.0pg/ml，经PDGF刺激的空白组TF蛋白水平在93.1±2.0pg/ml。

将本发所得HBCS:TF-siRNA纳米颗粒采用CCK-8细胞增殖活性进行分析，评估TF-siRNA对细胞活性的影响。图5分别在24、48和72小时不同时间段分析细胞增殖活性，经统计分析得出，空白组、阴性对照组没有发现显著差异（P>0.05）。然而，实验组显示明显的下降趋势，与其它两组相比，有统计学意义（P<0.05），特别是在48h和72h尤为明显。

将本发明所得采用AO/EB染色的HUVSMC使用荧光显微镜放大200倍进行观察，由图6可以看出，空白组几乎无凋亡和坏死细胞；实验组晚期凋亡细胞的均一的核结构，如核固缩、颗粒状，圆形或新月，膜外翻或起泡，以及凋亡的小体形成；坏死细胞显示，大的鲜红色的圆形；阴性对照组正常细胞呈现细胞绿色淡染细胞核，并显示细胞结构样特征；少量早期凋亡细胞表现出了强劲的绿色的核和染色质的碎片；几乎没有晚期凋亡或坏死细胞。箭头指向表示细胞的生存状态。

将本发明所得细胞转染72h后使用流式细胞仪检测细胞凋亡情况（annexinV/PI染色分析HUVSMC的凋亡率）；由图7可以看出，与空白组和阴性对照组相比，实验组具有较高的凋亡率，较低的存活率。

将本发明的血管支架和裸金属血管支架分别进行在体实验，由图8可以看出，预试验在体小型猪植入裸金属支架12周后，冠脉造影出现再狭窄；预试验在体小型猪植入羟丁基壳聚糖携载组织因子siRNA涂层血管支架12周后，冠脉造影未出现再狭窄。

因此，本发明所得羟丁基壳聚糖运载系统满足非毒性载体的各种参数；荧光素标记的siRNA的纳米复合物成功导入HUVSMC，转染效率在70%以上，实现了高转染效率；ELISA分析表明，实验组TF蛋白的表达明显降低，与阴性对照组和空白组差异有统计学意义（P>0.05）；CCK-8增殖试验表明，与阴性对照组和空白组相比，实验组细胞增殖活力也明显较低，差异有统计学意义（P<0.05）；AO/EB染色和流式细胞仪分析显示，实验组有较高的凋亡率，较低的存活率；本发明相对于现有技术具有明显的优势。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。