细胞自噬在HER2阳性乳腺癌细胞获得Lapatinib耐药过程中的机制和功能研究

摘要

从20世纪70年代末开始，全球乳腺癌的发病率呈持续上升趋势。2014年美国肿瘤学会在《肿瘤临床医生期刊》（A Cancer Journal for Clinicians）公布的数据显示，乳腺癌依旧是女性人群中最为常见的癌症。据其预计，乳腺癌将占女性所有新发肿瘤（Estimated New Cases）的四分之一左右，死亡率（Estimated Deaths）也仅次于肺癌，排名第二。中国虽然不是乳腺癌的高发国家，但近年来发病率却一直处于高位。截至2008年，中国乳腺癌新发数量占全世界的12.2％，死亡数量则占到了9.6%。尤其值得注意的是，我国乳腺癌患者的平均诊断年龄约为50岁，与西方女性的平均年龄（约为61岁）相比提前了约11年时间。由此可见，无论在西方国家还是在我国，乳腺癌都已成为女性最常见的、发病率最高的恶性肿瘤，而且在我国的发病年龄正趋于年轻化，严重影响着女性身心健康。
　　目前，乳腺癌的治疗方法主要包括手术、化疗、放疗和分子靶向药物治疗等多种手段。其中，分子靶向药物的研发和应用最为迅速。依据人表皮细胞生长因子受体2（Human Epidermal growth factor Receptor-2，HER2）、雌激素受体（Estrogen Receptor，ER）和孕激素受体（Progesterone Receptor，PR）三种受体在乳腺癌细胞的不同表达水平，将乳腺癌分为四种不同的亚型，即Luminal A型、Luminal B型、HER2阳性和三阴型。HER2是一个与肿瘤发生密切相关的细胞膜表面受体，它的高表达与乳腺癌患者的不良预后密切相关。经统计显示，有近1/4的乳腺癌患者属于 HER2阳性，而这类患者的预后较差，且恶性程度较高。因此，针对 HER2受体的分子靶向药物研究显得尤为重要。美国Genentech公司研发了人源化HER2单克隆抗体--曲妥珠单抗（Trastuzumab，商品名：赫塞汀，Herceptin），因其联合化疗可以显著延长HER2阳性转移性乳腺癌的总生存期，于1998年获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市，成为单克隆抗体类靶向药物研究的里程碑。随后，FDA又批准将 Trastuzumab第一个用于乳腺癌的新辅助治疗。不幸的是，大部分HER2阳性患者在使用Trastuzumab治疗1年左右会出现耐药现象，进而导致肿瘤转移复发。
　　拉帕替尼（Lapatinib）是葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）研发的一种针对 HER2的新型小分子抑制剂，它可以同时抑制 HER2和表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）胞内段的ATP结合位点，阻断下游增殖信号的传递，从而达到抗肿瘤的目的。2007年该药被FDA批准应用于临床，与卡培他滨（Capecitabine）合并治疗晚期或复发性的乳腺癌，特别是已经发生Trastuzumab耐药的乳腺癌。临床研究发现，联合应用Capecitabine和Lapatinib治疗复发性晚期或转移性乳腺癌，可明显延长疾病的进展时间（Time to Progression，TTP）和无疾病进展生存期（Progression-Free Survival，PFS）。这证明Lapatinib对进展期乳腺癌具有明显的治疗效果。研究表明，表皮生长因子（Epidermal Growth Factor，EGF）等配体与HER2受体结合后可以激活HER2信号转导通路，诱发下游信号分子通路的级联反应。HER2受体的活化可以诱导PI3K、Akt、mTOR、p70SK等分子的活化，促使其发生磷酸化，加速肿瘤细胞的增殖。而Lapatinib则通过阻断HER2下游促增殖信号的传递，抑制PI3K、Akt等分子活化和HER2阳性乳腺癌细胞的增殖，从而达到治疗肿瘤的目的。可是，临床试验显示Lapatinib的临床反应率仅有24%左右，获益率也处于较低水平。原发性或获得性耐药严重制约着Lapatinib在临床的应用，治疗失败的主要原因是产生耐药，阐明其耐药性机制并进行有效的干预，将有助于进一步提高该药的临床应用价值。
　　自噬（Autophagy）是细胞在营养不足、药物干预等极端条件下进行自我保护的重要机制之一。自噬可以促进细胞生存，但是过度的自噬却促进细胞凋亡。因此，究竟“细胞自噬是促进还是抑制肿瘤细胞的存活”是一个充满争议的话题。近期有研究表明，细胞自噬可能参与肿瘤细胞获得耐药性的过程，而 PI3K/Akt/mTOR、LKBI/AMPK/mTOR等信号通路可能是细胞自噬发生的主要上游调控分子。同时，细胞中的活性氧类（Reactive Oxygen Species，ROS）与自噬也表现出密切的关系，参与到肿瘤细胞耐药性的获得过程中，激活耐药细胞的ROS水平可能成为逆转肿瘤耐药的重要机制之一。
　　基于以上研究背景，我们试图通过本课题的探索回答如下问题：（1）在HER2阳性乳腺癌细胞获得Lapatinib耐药性的过程中，细胞自噬是否发挥重要作用？（2）是否可以通过抑制细胞自噬过程恢复Lapatinib的治疗敏感性？（3）细胞自噬活化的分子机制是什么？（4）小檗碱（Berberine，BR）等药物是否可以通过上调ROS水平杀伤Lapatinib耐药细胞？通过解答以上问题，我们将明确HER2阳性乳腺癌细胞获得Lapatinib耐药性的机制，并为恢复Lapatinib的治疗敏感性提供重要理论依据。
　　研究方法和结果：
　　1.具有Lapatinib耐药性的HER2阳性细胞株的筛选及耐药性分析：（1）利用Lapatinib处理HER2高表达的乳腺癌细胞系BT-474和AU-565，逐渐增加Lapatinib的作用浓度，维持筛选12个月，最终获得具有Lapatinib耐药性的细胞；（2）利用MTT、平板克隆和软琼脂克隆形成能力分析等方法对BT-474耐药细胞（BT-474LapR）和AU-565耐药细胞（AU-565LapR）的耐药能力进行检测。结果：所筛选的耐药细胞经过细胞增殖、平板克隆形成以及软琼脂克隆形成等多方面检测均表现出稳定的耐药性，可以满足后续机制研究的需要。
　　2.细胞自噬促进HER2阳性细胞株获得Lapatinib耐药性的功能评价：（1）利用透射电镜分析细胞自噬体是否在BT-474LapR和AU-565LapR细胞中增加；（2）用细胞自噬标记分子GFP-LC3融合蛋白转染BT-474和AU-565细胞系，并用激光共聚焦显微镜观察自噬体的分布变化；（3）利用MTT、EDU、平板克隆和流式细胞术等方法对BT-474LapR和AU-565LapR细胞进行检测，观察细胞的功能变化；（4）利用细胞自噬的抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine,3-MA）、氯喹（Chloroquine，CQ）和巴伐洛霉素A（Bafilomycin A，BA）联合Lapatinib作用耐药细胞，并进行细胞增殖能力和凋亡分析。结果：细胞自噬可以促进HER2阳性细胞株获得Lapatinib耐药性，抑制细胞自噬可以显著增强耐药细胞对Lapatinib的治疗敏感性。
　　3.细胞自噬在Lapatinib耐药细胞中活化的机制分析：（1）利用Western-blotting技术分析 AMPK-mTOR信号通路相关分子在BT-474Par和BT-474LapR细胞中的表达差异；（2）利用AMPK磷酸化的抑制剂Compound C阻断AMPK下游信号通路，分析其对耐药细胞功能的影响。结果：磷酸化AMPK在BT-474LapR细胞中的表达明显增加，提示AMPK在耐药细胞中处于活化状态，这可能是诱发细胞自噬的主要原因。Compound C阻断AMPK下游信号通路后，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转化受到明显的阻断，细胞水平的Lapatinib治疗敏感性显著增加。
　　4. Lapatinib耐药细胞的ROS状态分析及BR干预研究：（1）利用MTT、EdU、流式细胞术等方法检测Lapatinib和/或BR对BT-474LapR细胞增殖和凋亡功能的影响；（2）利用ROS试剂盒检测BR对BT-474Par和BT-474LapR细胞ROS水平的影响。结果：利用DCFH-DA标记和流式细胞术分析，发现BT-474LapR细胞的ROS水平显著低于 BT-474Par细胞。BR可以通过上调 ROS水平显著增加耐药细胞对Lapatinib的治疗敏感性，并诱导耐药细胞凋亡。
　　结论：
　　1.所筛选的Lapatinib耐药乳腺癌细胞系BT-474和AU-565具有稳定的耐药性；
　　2. Lapatinib耐药细胞的自噬形成能力增加，并促进 HER2阳性细胞获得 Lapatinib耐药性；
　　3.利用自噬抑制剂阻断耐药细胞的自噬过程有助于恢复耐药细胞对 Lapatinib的治疗敏感性；
　　4. BR可通过上调ROS水平恢复耐药细胞的治疗敏感性。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

一、HER2阳性乳腺癌及Lapatinib应用现状

二、细胞自噬研究进展

三、活性氧（ROS）与肿瘤耐药

四、小檗碱的抗肿瘤作用研究

第一部分 Lapatinib耐药HER2阳性细胞株的筛选及耐药性分析

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 细胞自噬促进HER2阳性细胞株获得Lapatinib耐药性的功能评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 细胞自噬在Lapatinib耐药细胞中活化的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 Lapatinib耐药细胞的ROS水平分析及BR干预研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢