TRPV4通过激活胶质细胞参与次声引起的神经元损伤

摘要

背景：次声是频率小于20Hz的声波，它在多种自然环境和人工环境中广泛存在。自然次声源包括雷暴天气、湍流、火山喷发、海啸、地震等，有研究显示次声检测可能可以用于火山、地震的监测和预警。人造次声源包括爆破、大型燃烧过程、压缩机、航天设备、大型的工业设备和交通工具。由于人们组织器官的固有频率在次声的频率范围之内(例如头部为8-12Hz)，因此次声可能通过与细胞成分产生共振来产生损伤效应，严重者可能产生声相关疾病(Vibroacoustic disease，VAD)。随着工业技术的发展，次声越来越成为损害人们健康的环境污染因素。
　　中枢神经系统更容易发生次声损伤。我们前期的动物研究发现，一定频率和声压级的次声暴露可以损伤动物的学习和记忆能力，减少海马的神经发生，引起海马神经元的凋亡，促进大鼠脑内小胶质细胞的活化。我们还发现，次声引起的神经损伤与钙离子内流增多有关。但是对次声脑损伤的确切机制，我们仍然知之甚少。是什么机制，将次声这种听觉刺激转变为细胞内的生物信号，并进一步引起神经元损伤的呢？
　　TRPV4是一种对钙离子通透的非选择性阳离子通道。我们前期发现，它作为一种机械刺激感受分子，在星形胶质细胞和小胶质细胞中有较高表达，另外次声暴露后，大鼠脑内TRPV4表达上升。因此，作为后续研究，本实验探讨了TRPV4分子与次声引起的中枢神经系统损伤之间的关系。
　　研究目的：1、明确次声暴露后胶质细胞活化与神经元损伤间的关系；2、明确TRPV4在次声暴露后胶质细胞活化和神经元损伤中的作用。
　　研究方法：1、16Hz/130dB次声处理成年大鼠，在次声处理的不同时程，处死大鼠，观察海马CA1区神经元数量和TUNEL染色阳性的凋亡细胞数量。然后向大鼠海马注射氟代柠檬酸以抑制星形胶质细胞活化，或者腹腔注射米诺环素以抑制小胶质细胞活化，观察相同程度的次声暴露后，CA1区神经元数量的变化和凋亡情况。2、对体外培养的胶质细胞进行次声刺激，在之后不同时间点收集培养液上清，用液相芯片的方法检测其中细胞因子含量的变化(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、和TNF-α)。然后用次声处理后胶质细胞培养液上清处理神经元，观察对其凋亡的影响。最后向次声处理后胶质细胞培养液上清中，加入IL-1β和TNF-α的中和抗体，观察对神经元凋亡的影响。3、用免疫荧光染色和Western blot的方法观察次声处理后，培养的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞 TRPV4表达的变化。4、用 RNAi的方法下调胶质细胞TRPV4的表达，或者用特异性抑制剂RN1734处理胶质细胞，检测次声处理后其培养液上清中炎症因子的含量。然后分别用培养液上清处理神经元，观察对其凋亡的影响。5、用激光共聚焦显微镜检测胶质细胞内钙离子浓度，观察次声对钙离子内流的影响。然后在trpv4 siRNA或者RN1734处理的胶质细胞，观察次声后胞内钙离子浓度变化，研究 TRPV4对次声介导的钙离子内流的影响。6、为了了解TRPV4与胶质细胞释放炎症因子之间的调控机制，我们研究了TRPV4对NF-κB信号分子的影响。我们用Western blot的方法，分别用TRPV4激动剂4α-PDD、抑制剂RN1734和trpv4 siRNA处理胶质细胞，观察对次声后NF-κB p65亚基核转位和IκB磷酸化的影响。7、为了进一步了解次声后钙离子内流和NF-κB激活之间可能涉及的信号分子，我们分别用钙调蛋白抑制剂CGS9343B、蛋白激酶C抑制剂Ro318220、p38 MAPK抑制剂SB20358、JNK抑制剂SP600125、和PI3K抑制剂 LY294002处理体外培养的胶质细胞，观察对次声后NF-κB p65亚基核转位和IκB磷酸化的影响。
　　研究结果：1、较长时间的次声暴露(2h/d，7–14d)引起大鼠海马神经元明显减少，利用氟代柠檬酸或米诺环素抑制星形胶质细胞或小胶质细胞活化能减少次声后神经元的凋亡。2、次声暴露使培养的星形胶质细胞和小胶质细胞培养液上清中炎症因子IL-1β和TNF-α水平明显上升；用上清处理神经元，促进后者凋亡；向培养液中加IL-1β和TNF-α的中和抗体，能减少神经元凋亡。3、TRPV4在胶质细胞表达较高，在神经元表达较低。次声处理后，培养的星形胶质细胞和小胶质细胞中TRPV4表达上调，而神经元中未见明显改变。4、用 RNAi的方法下调胶质细胞 TRPV4的表达，或者用抑制剂RN1734处理胶质细胞，次声暴露后胶质细胞培养液上清中IL-1β和TNF-α含量明显减少，对体外培养的神经元的损伤作用也减弱。5、次声暴露能引起胶质细胞内钙离子浓度升高。用RNAi的方法下调胶质细胞TRPV4的表达，或者用抑制剂RN1734处理胶质细胞，均抑制了次声暴露后胞内钙离子浓度升高。6、次声暴露后，胶质细胞 NF-κB激活，表现为 p65亚基核转位和IκB磷酸化均明显增强。抑制剂RN1734和trpv4 siRNA处理胶质细胞，能抑制次声引起的NF-κB激活。7、钙调蛋白抑制剂CGS9343B和蛋白激酶C抑制剂Ro318220抑制了次声暴露后，胶质细胞NF-κB的活化。而p38 MAPK抑制剂SB20358、JNK抑制剂SP600125、和PI3K抑制剂 LY294002对NF-κB的活化没有明显影响。
　　结论：我们发现，机械刺激敏感通道TRPV4可能通过激活胶质细胞参与了次声暴露引起的神经元损伤。抑制TRPV4，能减少次声暴露后钙离子内流，减少NF-κB信号通路的激活，抑制胶质细胞分泌炎性因子(IL-1β、TNF-α等)，最终减少次声后的神经元损伤。

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前言

文献回顾

1、声相关疾病（Vibroacoustic disease，VAD)

2、次声及其生物学效应

3 对机械刺激敏感的离子通道(mechanosensitive channel，MSC)

实验一 次声暴露通过激活胶质细胞引起神经元凋亡

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4.讨论

实验二 次声通过激活TRPV4通道引起胶质细胞活化

1实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

实验三 次声暴露可通过TRPV4激活转录因子NF-κB

1、实验材料

2、实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢