P物质及其NK-1受体参与大鼠外周伤害性信息传入引起的脊髓后角小胶质细胞的激活

摘要

目的:近年来，随着对中枢神经系统小胶质细胞功能研究的深入，其在外周神经损伤及炎症诱发的病理性痛中的作用越来越受到重视。研究发现，在外周神经损伤引起的神经病理性痛模型中或福尔马林、角叉菜胶等引起的炎性痛模型中，均伴有脊髓后角小胶质细胞的激活。活化激活的小胶质细胞通过产生和释放多种促炎细胞因子如白介素-1β，肿瘤坏死因子-α等，上调表达多种活性蛋白或受体，如补体受体CD4、C3、CX3CR1，ATP受体P2X(4)等，直接或间接作用于痛觉传递神经元，使其敏化，参与病理性痛及痛觉过敏的产生与维持。而给予小胶质细胞抑制剂米诺环素抑制小胶质细胞的激活后，可显著抑制病理性痛及痛觉过敏的产生。以上研究表明，小胶质细胞的激活在病理性痛及痛觉过敏的产生和维持中发挥重要作用。但在这一过程中，小胶质细胞激活的具体机制尚不完全清楚。
　　P物质(Substance P，SP)是脊髓内重要的神经激肽类递质，被认为是痛觉传递的重要信使。传统观念认为，SP主要存在于脊髓Ⅱ板层初级传入纤维（C类纤维）末梢中。它的受体神经激肽-1(neurokinin-1，NK-1)受体主要分布在脊髓后角Ⅰ板层神经元的树突和胞体上。SP通过与其NK-1受体结合发挥作用，参与脊髓伤害性信息的传递。但是近年来的研究发现，除了初级传入末梢外，人胚和鼠类的小胶质细胞也可以释放大量的SP。同时，除了介导痛觉传递的二级神经元胞体外，人胚和鼠类的小胶质细胞上也表达着有功能的NK-1受体。因此，伤害性信息传入时，引起SP释放也可能通过胶质细胞膜上的NK-1受体参与脊髓小胶质细胞的激活。
　　因此，本实验通过观察应用NK-1受体拮抗剂L-732，138对大鼠蜜蜂毒(bee venom，BV)炎性痛及痛过敏时脊髓后角小胶质细胞CD11b/c(OX-42)表达的影响，探讨SP及其NK-1受体在外周伤害性信息传入引起的脊髓后角小胶质细胞激活中的作用。
　　方法:雄性Sprague-Dawley大鼠84只，体重250-280 g，随机分为以下5组:
　　①Sham组(n=24):于正常大鼠右后足底皮下注射生理盐水50μl。
　　②蜜蜂毒组(n=24):于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　　③蜜蜂毒+L-732，138组(n=12):给大鼠椎管内注射10μl NK-1受体拮抗剂L-732，138(200 nmol)，15min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　　④蜜蜂毒+DMSO组(n=12):给大鼠椎管内注射10μl80％DMSO（L-732，138的溶剂），15 min后于大鼠右后足底皮下注射蜜蜂毒溶液(4g/L)50μl。
　　⑤Sham+L-732，138组(n=12):给大鼠椎管内注射10μl NK-1受体拮抗剂L-732，138（200 nmol），15 min后于大鼠右后足底皮下注射50μl生理盐水。
　　各组大鼠于足底注射生理盐水或蜜蜂毒溶液后即刻计数1h内自发缩足次数，观察其自发痛反应变化;并于足底注射前1d、注射后1d、3d、7d测定热缩足反射潜伏期及机械缩足反射阈值的变化;Sham组与蜜蜂毒组于足底注射后1h、1d、3d、7d取材，其余各组于足底注射后3d取材，冰冻连续切片，应用免疫组化法观察L5节段脊髓后角CD11b/c(OX-42)蛋白的表达，以观察脊髓后角小胶质细胞的激活状态。
　　结果:
　　1 NK-1受体拮抗剂L-732，138减轻足底注射蜜蜂毒大鼠的自发痛及痛过敏反应
　　1.1自发痛行为反应
　　足底注射生理盐水后，大鼠不产生自发痛行为，而足底注射蜜蜂毒后，大鼠出现明显的自发痛行为，表现为紧张性的舔，咬和剧烈抖动注射足，注射足抬高，不持重或持重减轻等行为，自发痛反应评分显著增加(P＜0.05)。与蜜蜂毒组相比，椎管内预先注射L-732，138后，大鼠的自发痛行为反应有所减轻，自发痛反应评分显著降低（P＜0.05）;而椎管内预先注射DMSO对注射蜜蜂毒引起的自发痛行为无显著影响。椎管内注射L-732，138不会引起sham组大鼠的自发痛行为。
　　1.2热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值
　　与注射前相比，足底注射生理盐水（sham组）后1d、3d和7d，大鼠注射足的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值无显著变化。足底注射蜜蜂毒后，上述各时间点大鼠注射足的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值均较sham显著降低(P＜0.05)，其中以注射后1d降低最为显著，3d、7d逐渐回升，表明足底注射蜜蜂毒诱发大鼠产生了热和机械性痛觉过敏。椎管内预先注射L-732，138可显著抑制注射蜜蜂毒大鼠热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值的下降(P＜0.05);而椎管内预先注射DMSO对注射蜜蜂毒大鼠的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值无显著影响。椎管内注射L-732，138对sham组大鼠的热缩足反射潜伏期和机械缩足反射阈值无显著影响。
　　2 NK-1受体拮抗剂L-732，138抑制蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小胶质细胞的激活
　　免疫组化染色结果显示，CD11b/c(OX-42)在sham组大鼠L5节段脊髓后角有一定量的基础表达，免疫反应阳性细胞较少，胞体较小，突起较细，散在分部于脊髓后角。大鼠足底注射蜜蜂毒1h后，脊髓后角免疫反应阳性细胞未见明显变化;注射后1d时，免疫阳性细胞数量显著增多，胞体增大，突起变粗，免疫染色积分光密度值显著增大（P＜0.05）;注射后3d时，CD11b/c(OX-42)表达达到高峰;注射后7d时，虽然CD11b/c（OX-42）阳性表达水平仍较高，但较3d时有所减少。以上结果表明，脊髓后角小胶质细胞在蜜蜂毒炎性痛模型中受到炎性刺激后1d开始激活，3d时激活达到高峰，7d时开始减弱。
　　在上述实验的基础上，选择小胶质细胞激活最明显的3d时间点，观察NK-1受体拮抗剂L-732，138对蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小胶质细胞激活的影响。结果发现，预先椎管内给予NK-1受体拮抗剂L-732，138后，可显著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角CD11b/c(OX-42)表达的上调，表现为免疫阳性细胞数量减少，胞体缩小，突起变细，免疫染色积分光密度值显著降低(P＜0.05)。表明NK-1受体拮抗剂L-732，138抑制了蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小胶质细胞的激活。
　　结论:
　　1、大鼠足底注射蜜蜂毒可引起大鼠自发痛反应及热和机械性痛觉过敏，同时引起大鼠脊髓后角小胶质细胞的激活。
　　2、NK-1受体拮抗剂L-732，138可显著抑制蜜蜂毒引起的大鼠脊髓后角小胶质细胞的激活，同时可减轻蜜蜂毒引起的大鼠自发痛反应及热和机械性痛觉过敏。
　　3、上述结果提示，SP及其NK-1受体参与伤害性信息传入所致脊髓后角小胶质细胞的激活。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验动物及分组

2 实验方法

3 主要仪器

4 主要试剂

5 统计学处理

结果

1 NK-1受体拮抗剂L-732，138减轻足底注射蜜蜂毒大鼠的自发痛及痛过敏反应

2 NK-1受体拮抗剂L-732，138抑制蜜蜂毒炎性痛大鼠脊髓后角小胶质细胞的激活

附图

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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