活体荧光成像评估Ag85A和Ag85B DNA疫苗对小鼠膀胱癌移植瘤的疗效

摘要

目的：大量提取质粒PVAX1-Ag85A、PVAX1-Ag85B；制备肿瘤发射红色荧光的可视化小鼠膀胱癌移植瘤动物模型，运用活体红色荧光成像技术及影像学特征评估Ag85A和Ag85BDNA疫苗分别抑瘤的免疫治疗效果。为肿瘤光学分子成像的应用提供基础研究以及DNA疫苗的发展应用提供直观、可靠的理论依据。
　　 方法：首先将含质粒PVAX1-Ag85A及PVAX1-Ag85B的细菌(E.coli JM109)在液体培养基中大量培养，然后用质粒抽提试剂盒大量提取质粒Ag85A、Ag85B，并进行酶切鉴定，最后定量至实验所需浓度(1mg/ml)，备用。将含香菇珊瑚红色荧光蛋白(Discosomasp.redfluorescent protein，DsRed)基因的质粒载体采用脂质体法转染至小鼠膀胱移行细胞癌(BTT)细胞，筛选并扩大培养后，将其皮下种植于615小鼠后肢大腿内侧，建立肿瘤发射红色荧光的小鼠膀胱癌移植瘤模型，将建模成功的24只小鼠随机分为PVAX1-Ag85A DNA疫苗组(简称Ag85A组)、PVAX1-Ag85B DNA疫苗组(简称Ag85B组)和生理盐水组，各8只，各组分别自右后肢肿瘤细胞种植后第6、13、20天，于小鼠右后肢肌肉内注射Ag85A、Ag85B及生理盐水。然后各组分别于种植后第6、13、20、27天，进行活体荧光影像的摄取，观察移植肿瘤生长和荧光强度的影像学特征。第28天处死小鼠，各组分别分离肝、肺、肾、腹腔淋巴结组织，将新鲜的组织制成1mm3小块切片，荧光显微镜下观察。
　　 结果：
　　 1.成功制备了重组质粒PVAX1-Ag85A及PVAX1-Ag85B的DNA疫苗。所抽提质粒DNA所含杂质少，能满足实验需要。
　　 2.成功转染DsRed基因至小鼠膀胱移行细胞癌(BTT)细胞(BTT-DsRed)，转染的细胞活力好，其红色荧光不随细胞传代次数的增多而衰减。
　　 3.成功制备肿瘤发射红色荧光的可视化小鼠膀胱癌移植瘤动物模型，致瘤率100％。
　　 4.于右后肢肿瘤细胞种植后第一周和第二周，活体红色荧光成像结果显示各组肿瘤细胞荧光强度无明显差异，其差异无统计学意义(P＞0.05)。第三周，活体红色荧光成像结果显示Ag85B DNA疫苗组肿瘤荧光强度值明显低于生理盐水组，其差别有统计学意义(P＜0.05)；第四周Ag85A和Ag85B DNA疫苗组肿瘤荧光强度值分别明显低于生理盐水组，其差别有统计学意义(P＜0.01)，但Ag85B与Ag85A DNA疫苗相比，肿瘤荧光强度值的差别无统计学意义，P＞0.05。
　　 5.各组小鼠肝、肺、肾均未发现肿瘤细胞转移，Ag85B DNA疫苗组肿瘤远处淋巴结转移率(25％)明显低于生理盐水组(87.5％)和Ag85A组(62.5％)，其差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.运用活体红色荧光成像技术摄取移植瘤的荧光影像学特征，能够动态、客观、灵敏、可视化地评估DNA疫苗对小鼠膀胱癌移植瘤的真实抑瘤效应。
　　 2.Ag85A、Ag85B DNA疫苗能够显著降低小鼠膀胱肿瘤移植瘤的荧光强度，显示其具有肿瘤免疫效应。
　　 3.小鼠膀胱癌皮下移植瘤主要为淋巴结转移，Ag85B DNA疫苗具有明显的抑制肿瘤远处转移的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

材料和方法

1.实验材料、仪器和试剂

2.实验方法

实验结果

1.质粒PVAX1-Ag85A和PVAX1-Ag85B的酶切鉴定及定量

2.培养的小鼠膀胱移行细胞癌细胞(BTT)

3.成功转染DsRed基因的小鼠BTT细胞(BTT-DsRed)

4.BTT-DsRed细胞生长曲线

5.成功制备肿瘤含红色荧光蛋白基因的小鼠膀胱癌移植瘤动物模型

6.在不同的时间段，各组小鼠膀胱癌移植瘤活体荧光成像的荧光强度结果

7.细胞水平的成像

讨 论

结 论

参考文献

·综述1·分子活体荧光成像在肿瘤研究中的应用

·综述2·Ag85A和Ag85BDNA疫苗腔内灌注在膀胱癌治疗中的应用

个人简介

致谢