高糖对大鼠膀胱平滑肌细胞中钙库操控的钙离子通道的作用研究

摘要

目的：
　　探索高糖对大鼠膀胱平滑肌细胞（bladder smooth muscle cells，BSMCs）中钙库操控的钙离子通道（store-operated calcium channel，SOCC）的影响。通过高糖处理BSMCs，模拟糖尿病膀胱（diabetes cystopathy，DCP）体外环境，探究BSMCs中SOCC的相关变化，为 DCP的病因学及其治疗提供新的思路。
　　方法：
　　使用Ⅱ型胶原酶分离S-D大鼠BSMCs，并用α-SMA进行免疫荧光鉴定。分离的原代BSMCs进行培养传代。将传至第3-5代的BSMCs同步化后根据培养基成分及浓度分为：正常葡萄糖浓度组（葡萄糖5.5mmol/L，NG组)，甘露醇高渗组（葡萄糖5.5mmol/L+甘露醇19.5mmol/L，OC组)，高葡萄糖浓度组（葡萄糖25mmol/L， HG组)三组，于37℃、5％CO2的孵箱中培养2.5天。各组BSMCs负载Fluo-4AM，通过激光共聚焦显微镜观察记录三组BSMCs激活（CPA，10umol/L）和抑制SOCC（SKF-96365，10umol/L）后细胞内荧光强度值，计算其荧光强度值（F1）与背景荧光强度值（F0）的比值（F1/F0）来比较各组间钙离子浓度的变化。通过RT-qPCR法和Western blot法检测三组BSMCs中SOCC相关蛋白STIM1和Orai1的表达情况。
　　结果：
　　经过α-SMA免疫荧光鉴定证实成功分离培养出膀胱平滑肌细胞。HG组加入SOCC激动剂CPA后较NG组、OC组钙离子浓度的显著增加（2.105±0.105， P<0.05），加入SOCC抑制剂SKF-96365后较NG组、OC组钙离子浓度的显著降低（1.610±0.109，P<0.05），NG组与OC组之间无明显差异（P>0.05）；HG组BSMCs中STIM1和Orai1的mRNA表达水平以及蛋白表达水平明显高于NG组、OC组（P<0.05），NG组与OC组之间无明显差异（P>0.05）。
　　结论：
　　经过2.5天高糖作用下能激活大鼠膀胱平滑肌细胞的SOCC，可能参与组成细胞外钙离子内流部分，从而参与相应的病理生理机制。另外，在高糖作用下，BSMCs中SOCC组成分子STIM1和Orai1表达水平发生改变可能为DCP的病理机制提供体外实验依据，从而为DCP病因学研究提供新的思路。但高糖对SOCC的作用机制尚不清楚，仍需后续研究。
　　本课题为国家自然科学基金“肌肉特异性微小RNA联合成肌调节因子MyoD逆转糖尿病大鼠膀胱重构的实验研究（编号：81370861）”。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 免疫荧光法鉴定BSMCs

2.2 激光共聚焦显微镜测定各组BSMCs中钙离子浓度的变化

2.3 RT-qPCR测定STIM1和Orai1的mRNA相对表达量

2.4 Western blot测定STIM1和Orai1的蛋白相对表达量

3 讨 论

3.1 膀胱平滑肌细胞的培养与鉴定

3.2 模拟DCP体外环境测定细胞内Ca2+浓度变化及SOCC相关蛋白的表达水平

4 结 论

参考文献

综述:钙库操控的钙离子通道在平滑肌细胞中的作用

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