钙库操控的钙离子通道在糖尿病大鼠膀胱收缩功能中作用的实验研究

摘要

目的:
　　构建不同时间段STZ诱导的DM大鼠动物模型。通过激活或失活SOCCs通道，运用离体逼尿肌肌条收缩实验来研究SOCCs在DCP疾病中对膀胱肌条收缩功能的作用。通过原代逼尿肌细胞分离培养，培养出原代逼尿肌细胞。采用SOCCs的激活剂和抑制剂，研究激活或失活该通道后，DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度的变化。并研究不同糖尿病病程作用下，大鼠膀胱中SOCCs关键分子STIM1和Orai1的mRNA水平和蛋白水平表达的改变情况。
　　方法:
　　1.6-8周雌性S-D大鼠70只，按年龄分为每组10只，其中正常对照组（normal control，N组）4组，实验组（diabetes mellitus,DM组）3组。DM组：单次腹腔注射pH4.5，0.1mmol/L的柠檬酸缓冲液溶解的链脲佐菌素（streptozotocin,STZ），50mg/kg。N组：单次腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。具体分组：
　　DM组：
　　（1）4周实验组（DM4W组）：注射STZ，成模后4周处死。
　　（2）8周实验组（DM8W）：注射STZ，成模后8周处死。
　　（3）12周实验组（DM12W）：注射STZ，成模后12周处死。
　　N组：
　　（1）0周对照组（N0）：注射缓冲液后3天后处死。
　　（2）4周对照组（N1）：注射缓冲液后4周后处死。
　　（3）8周对照组（N2）：注射缓冲液后8周后处死。
　　（4）12周对照组（N3）：注射缓冲液后12周后处死。
　　注射药物3天后测量随机血糖三次，血糖值均大于16.7mmol/L，认为DM模型构建成功。其后观察处死时血糖，大鼠体重等指标变化，并留取膀胱组织进行HE染色，评估膀胱组织学改变。
　　2.分别制备8*3*3mm离体逼尿肌肌条，解剖显微镜下去除膀胱粘膜及浆膜层，置于kreb’s液中，通过给予环匹阿尼酸(cyclopiazonic Acid,CPA)激活SOCCs和SKF-96365抑制SOCCs来观察各组离体逼尿肌肌条收缩频率和收缩幅度的变化。
　　3.采用酶消化法来分离逼尿肌细胞进行原代细胞培养。具体使用胶原蛋白酶Ⅱ4mg/ml及牛血清白蛋白（BSA）4mg/ml，在37℃，5％CO2的条件下消化40-60分钟。观察所获得细胞形态、生长方式及α-SMA免疫荧光法检测平滑肌细胞特异性。
　　4.分离培养24h的原代逼尿肌细胞负载Fluo-4AM，通过激活和失活SOCCs通道，在激光共聚焦显微镜下观察和记录各组逼尿肌细胞荧光强度的变化，最后计算实测荧光强度（F1）比背景荧光强度(F0)的变化，即采用F1/F0来进行比较在SOCCs激活和失活后，各组细胞钙离子的变化。
　　5.RT-qPCR法和Western Blot法测定不同时间DM大鼠膀胱组织STIM1和Orai1分子的表达水平。
　　结果：
　　1.DM组大鼠血糖均大于16.7mmol/l，体重连续降低，与对照组对比，DM组大鼠体重下降具有统计学意义（p＜0.05），膀胱扩张明显，可见膀胱尿潴留，血糖也明显增高（p＜0.05）。HE染色提示随着糖尿病进展，DM组逼尿肌细胞增生，肥大，纤维组织排列紊乱，间质疏松。
　　2.加入CPA和SKF-96365后离体膀胱逼尿肌肌条收缩频率变化：
　　加入CPA后，所有实验组肌条收缩频率均增加。与对照组比较，DM4W组和DM8W组肌条收缩频率明显增加（DM4W vs N1：t=3.776,p=0.002；DM8W vs N2：t=2.282,p=0.039）。DM三组实验组之间比较，DM4W组与DM12W，DM8W组与DM12W，均表现为收缩频率增强（DM12W vs DM4W,p=0.039;DM12W vs DM8W,p=0.012），各个时间正常组间比较，无统计学意义。加入SKF-96365后，所有实验组肌条收缩频率降低。与对照组比较，DM4W和DM8W组肌条收缩频率仍较高（DM4W vs N1：t=-3.750,p=0.02；DM8W vs N2：t=-2.593,p=0.021）DM三组之间比较，DM12W组较其他两组明显高（DM12W vs DM4W,p=0.004;DM12W vs DM8W,p=0.021），具有统计学意义，各个时间正常组间比较，无统计学意义。
　　3.加入CPA和SKF-96365后离体膀胱逼尿肌肌条收缩幅度变化：
　　在所有实验组中加入 CPA后，逼尿肌肌条收缩幅度均下降；在加入SKF-96365后，收缩幅度均有所回升，但仍小于没加药前。各组之间逼尿肌肌条收缩幅度比较，差异不明显，没有统计学意义。
　　4.成功分离培养出膀胱逼尿肌细胞，细胞3-5天逐渐融合显片状生长，7天左右平滑肌融合达到80%以上。细胞呈平滑肌细胞典型的“峰-谷”样生长，α-SMA免疫荧染色阳性。
　　5.加入CPA后，激活SOCCs，所有实验组逼尿肌细胞相对荧光强度均增加，DM4W、DM8W与对照组比较相对荧光强度显著增强（DM4W vs N1：t=4.867, p=0.0002；DM8W vs N2：t=4.203,p=0.001），DM组之间比较，DM12W较其他两组明显降低(DM12W vs DM4W,p=0.001; DM12W vs DM8W,p=0.0004,DM8W vs DM4W,p=0.680），具有统计学意义。加入SKF-96365后，SOCCs失活，细胞相对荧光强度降低，与对照组比较DM4W, DM8W的荧光相对强度仍显著高于对照组（DM4W vs N1：t=3.141,p=0.007；DM8W vs N2：t=3.871,p=0.002），DM组之间比较，DM12W较其他两组明显降低（DM12W vs DM4W,p=0.003;DM12W vs DM8W,p=0.002,DM8W vs DM4W,p=0.914）。
　　6.在DM4W和DM8W组中，与对照组比较，Orai1mRNA和蛋白表达量显著增加（mRNA：DM4W vs N1：t=6.049,p=0.0001；DM8W vs N2：t=4.122, p=0.002蛋白：DM4W vs N1：t=8.862,p=0.001;DM8W vs N2：t=10.803,p=0.0004）。STIM1 mRNA表达量在DM4W组中显著增加（t=2.799,p=0.019），STIM1蛋白表达量在DM4W和DM8W组中显著增加（DM4W vs N1：t=6.540, p=0.003;DM8W vs N2：t=3.495）。DCP不同时间比较，Orai1mRNA的表达量在DM12W组中与其他DM组比较明显降低（DM12W vs DM4W,p=0.0001; DM12W vs DM8W,p=0.001, DM8W vs DM4W,p=0.329）；Orai1蛋白表达量也明显降低（DM12W vs DM4W,p=0.007;DM12W vs DM8W,p=0.011, DM8W vs DM4W,p=0.717）。STIM1mRNA的表达量在DM4W组中较其他 DM组明显增加（DM4W vs DM8W,p=0.013;DM4W vs DM12W, p=0.002, DM8W vs DM12W,p=0.409），而STIM1蛋白表达量在DM三组间均不同（DM12W vs DM4W,p=0.0003;DM12W vs DM8W,p=0.003,DM8W vs DM4W,p=0.046）。
　　结论：
　　1.成功建立SZT诱导的DM大鼠模型。在DCP疾病中，SOCCs参与调节了膀胱逼尿肌的收缩功能，SOCCs对膀胱逼尿肌收缩频率调节作用增强。
　　2.采用酶消化法成功分离培养了膀胱逼尿肌细胞，SOCCs参与了 DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度的调节。随着DCP病程进展，SOCCs对膀胱逼尿肌细胞钙离子调节作用先增强（4、8周）后减弱（12周）。
　　3.在DCP疾病4周时，Orai1和STIM1表达增强，糖尿病影响了大鼠膀胱SOCCs关键分子Orai1和STIM1的表达水平。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

第一部分 SOCCs对DM大鼠膀胱收缩功能的调节作用

（一） STZ诱导DM大鼠模型的建立

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

（二） SOCCs在DM大鼠逼尿肌肌条收缩功能中作用的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第二部分 SOCCs对DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度的调节

（一）膀胱逼尿肌细胞分离、培养与鉴定

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

（二） SOCCs对不同时间DM大鼠膀胱逼尿肌细胞钙离子浓度调节的实验研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

第三部分 糖尿病对大鼠膀胱STIM1和Orai1表达影响的研究

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

4 结 论

全文结论

参考文献

综述:糖尿病并发症中钙库操控的钙离子通道的作用

致谢

个人简历