提高11家族木聚糖酶嗜碱性的分子改造

摘要

木聚糖酶是降解植物半纤维素主要成分木聚糖的最关键的酶，广泛应用在动物饲料、食品、造纸、生物能源等工业。木聚糖酶应用在纸浆漂白工艺中可以减少有毒化学漂白剂的使用量，进而减少后序漂白废水的毒性和减轻对环境的污染。其中11家族木聚糖酶由于分子量小且无纤维素酶活性，很适合应用于纸浆漂白工艺中。在纸浆漂白过程中纸浆多处于高温碱性的环境下，为减少能耗和简化工艺流程，需要选用嗜碱耐高温的木聚糖酶。但是从自然界中分离到的野生型11家族木聚糖酶大多数是中性酶，嗜碱木聚糖酶数量十分有限。因此需要对现有的野生型11家族木聚糖酶进行分子改造来得到嗜碱性提高的木聚糖酶突变体。本研究以11家族木聚糖酶xyn11A-LC为基础，利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit随机突变木聚糖酶xyn11A-LC基因建立突变文库，从中筛选出嗜碱性提高的木聚糖酶突变体。主要研究成果如下：
　　1.利用GeneMorph II Random Mutagenesis kit随机突变木聚糖酶xyn11A-LC基因，建立了包含有5000多克隆的突变文库。
　　2.通过对构建的突变文库进行筛选，最终筛选出嗜碱性明显提高的突变体M52-C10。突变体M52-C10的最适pH与野生型的相比提高了0.5个单位，达到pH8.0，在pH8.5-pH10.0与野生型的相比提高了大约10-15％的相对酶活，最适温度为55℃，有较好的pH稳定性和温度稳定性。
　　3.对突变体M52-C10的测序结果分析显示出突变体M52-C10含有两个位点氨基酸的突变，分别是 E135 V和 V116 A。经过验证 E135 V对突变体M52-C10的嗜碱性提高起到主要作用。E135 V的最适p H比野生型的提高了0.5个单位，为p H8.0，在pH8.5-p H10.0与野生型的相比提高了10-20%的相对酶活，最适温度为55℃，有较好的pH稳定性和温度稳定性。
　　4.对E135位分别进行定点突变得到E135K和E135R。E135K的最适p H比野生型的提高了0.5个单位，为p H8.0，在p H8.5- p H10.0与野生型的相比提高了10-19%的相对酶活；E135 R的最适p H与野生型的相比提高了0.5个单位，达到p H8.0，在pH8.5-p H10.0与野生型的相比提高了大约15-25%的相对酶活，最适温度为55℃，有较好的pH稳定性和温度稳定性。
　　5.总共得到比野生型木聚糖酶xyn11 A-LC嗜碱性明显提高的三种突变体：E135 V、E135K和E135 R。

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目录

1.引言

1.1木聚糖酶

1.2木聚糖酶的应用

1.3木聚糖酶的分子改造

1.4本研究的前期工作基础及目的意义

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3.结果与分析

3.1随机突变文库的建立

3.2随机突变文库的筛选

3.3蛋白的纯化

3.4突变体的酶学表征

3.5突变体的位点验证

3.6蛋白结构模拟

3.7定点突变及其对酶活的影响

4.讨论

4.1突变文库的建立筛选及突变位点鉴定

4.2定点突变的选择及影响

5.结论

致谢

参考文献

攻读硕士期间发表论文