红景天甙和VC糖苷生物催化合成的研究

摘要

对有生物活性的化合物进行糖基化修饰，一方面可提高其生物活性，降低其毒副作用;另一方面可进行药物和基因的定向转运，增强药物和基因与靶点的结合，同时增强其内吸性和脂溶性，提高药效。糖类药物在各种疾病（如免疫系统疾病、感染性疾病、癌症、炎症等）的治疗上都显示了巨大的应用前景，因而，对药剂、有生物活性以及其它无生物活性的化合物进行糖基化修饰已经成为当今生物医药领域的研究热点。
　　迄今为止，糖基化修饰尤其是合成烷基糖苷的工业化生产还主要采用化学方法。但化学法得到的产品一般为各种异构体和副产物的混合物，也涉及多个保护和去保护步骤。如果用糖苷酶酶法催化合成糖苷，不仅立体选择性高，避免了保护和去保护等烦琐的反应步骤，而且反应条件温和，所得产物纯度高，收率高，对环境友好，反应所产生的废弃物易于处理。因此，本课题探索利用糖苷酶对一些羟基化合物进行定向的糖苷化修饰，得到具有潜在的应用价值的糖苷类药物。
　　研究目的:一方面，探索微生物来源的β-葡萄糖苷酶催化合成VC糖苷、VE糖苷以及其它一些具有生物活性的糖苷类化合物的可行性;另一方面，探索微生物来源的β-葡萄糖苷酶在非水相介质中催化合成糖苷类化合物的方法，并建立一套高效的酶法催化合成VC糖苷、VE糖苷、红景天甙等其它活性糖苷的反应体系和生产工艺。
　　研究方法及结果:
　　一、从苹果、梨等糖含量较高植物的根部土壤分离筛选到一株β-葡萄糖苷酶高产菌株，其酶活力达到107.9 U/mL，初步鉴定该菌种为米曲霉。通过三种不同的培养基发酵产酶后测其酶活，结果表明含水杨苷的液体培养基和固体发酵培养基均为产酶活力较高的培养基配方。
　　二、测定该米曲霉所产β-葡萄糖苷酶粗酶的最适温度、最适pH，并研究有机溶剂、金属离子和反应时间对该酶活性的影响，进而得出酶活测定及酶催化反应的最佳条件;β-葡萄糖苷酶粗酶液，经盐析、透析脱盐和冷冻干燥后获得浓度较高的酶制剂，该酶制剂的比活力达到127.6 U/mg，提纯倍数为2.39，回收率达到61.3％。
　　三、探索了在非水相介质中酶催化逆水解反应合成红景天甙的方法。本文利用β-葡萄糖苷酶高产菌株米曲霉发酵产酶，探索不同的有机溶剂、底物浓度、反应时间、pH值对β-葡萄糖苷酶催化酪醇和D-葡萄糖合成红景天甙的影响，优化了酶催化合成红景天甙的条件，使其转化率达到了18.1％，相当于7.39 g/L，远远高于米曲霉整体细胞催化的产量(0.7 g/L)。
　　四、利用米曲霉发酵产酶，催化维生素C和纤维二糖发生转糖基反应合成一种新型的VC葡萄糖苷:2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA2βG)，一种真正意义上源于天然的、稳定的维生素C前体。AA2βG由于在2位上有葡萄糖掩蔽，不会发生氧化反应，在生物体外具有氧化稳定性，在生物体内则缓慢释放维生C，在皮肤美容及保健方面有巨大的应用前景;与此同时，探索了一套在现有实验条件下分离纯化以及检AA2βG的方法，并对其进行红外光谱分析。本实验室用酶法催化合成AA2βG，立体选择性高，副产物少，只需一步反应就可完成，在国内未见报道。
　　五、VC本身就是米曲霉发酵培养基的必须成分，所以本试验初步探索了以VC和D-葡萄糖为底物，以β-葡萄糖苷酶高产菌株整体细胞作为催化体系，在菌体内合成目的产物的基本代谢情况，研究底物浓度、反应时间、反应液pH对整体细胞催化合成AA2βG的影响。实验结果表明最适底物浓度为抗坏血酸7g/L，D-葡萄糖浓度为5 g/L，最佳反应时间为48 h，最适pH为7。在最适条件下，AA2βG的最高合成量为0.23g/L。对细胞催化合成AA2βG的产量进行分析，说明细胞内的底物积累到一定浓度以后对细胞造成毒性时，细胞就会通过抗坏血酸的糖苷化反应形成2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸，这样既起到解毒功能，又储存过剩营养物质。该实验有待于我们对VC在菌体内的具体代谢情况作进一步的研究和探索。

目录

摘要

第一章 文献综述

1．1 糖基化修饰的研究进展

1．1．1 糖基化修饰与人类疾病

1．1．2 糖基化修饰的类型及其应用

1．1．3 糖基化修饰与糖苷酶

1．2 β-葡萄糖苷酶的研究进展

1．2．1 β-葡萄糖苷酶的存在方式

1．2．2 β-葡萄糖苷酶的理化性质

1．2．3 β-葡萄糖苷酶的催化反应机制

1．2．4 糖苷酶非水相催化合成烷基糖苷

1．3 红景天甙的研究进展

1．3．1 红景天药用价值及植物资源

1．3．2 红景天甙获取方法

1．4 维生素C糖苷的研究进展

1．4．1 VC的结构及性质

1．4．2 VC的主要用途及使用上的缺陷

1．4．3 新型VC衍生物：VC葡萄糖苷

1．5 本课题的研究目的和意义

第二章 β-葡萄糖苷酶高产菌株的筛选

2．1 材料

2．1．1 土样

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂及配制

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 菌种的培养

2．2．2 菌种的分离筛选

2．2．3 粗酶液的提取

2．2．4 β-葡萄糖苷酶活力测定

2．2．5 培养基筛选

2．3 结果与讨论

2．3．1 β-葡萄糖苷酶产生菌的分离筛选

2．3．2 酶活力测定

2．3．3 培养基筛选

2．4 结论

第三章 β-葡萄糖苷酶的粗分离及其性质研究

3．1 材料

3．1．1 菌种

3．1．2 培养基

3．1．3 主要试剂

3．1．4 主要仪器

3．2 实验方法

3．2．1 菌的培养及酶的提取

3．2．2 β-葡萄糖苷酶的性质研究

3．2．3 β-葡萄糖苷酶的粗分离

3．3 结果与讨论

3．3．1 β-葡萄糖苷酶的性质研究

3．3．2 β-葡萄糖苷酶的分离结果

3．4 结论

第四章 非水相介质中β-葡萄糖苷酶催化合成红景天甙的研究

4．1 材料

4．1．1 菌种

4．1．2 培养基

4．1．3 主要试剂

4．1．4 主要仪器

4．2 实验方法

4．2．1 β-葡萄糖苷酶粗酶制剂的制备

4．2．2 β-葡萄糖苷酶在非水相介质中催化合成红景天甙

4．3 结果与讨论

4．3．1 红景天甙HPLC检测

4．3．2 红景天甙的结构表征

4．3．3 催化条件的优化

4．4 结论

第五章 新型VC衍生物：2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的酶促合成

5．1 材料

5．1．1 菌种

5．1．2 培养基

5．1．3 主要试剂

5．1．4 主要仪器

5．2 实验方法

5．2．1 斜面培养

5．2．2 β-葡萄糖苷酶粗酶制剂的制备

5．2．3 β-葡萄糖苷酶催化合成AA2βG的反应

5．2．4 产物AA2βG的分离纯化

5．2．5 产物的HPLC检测

5．2．6 产物的结构表征

5．2．7 催化条件的优化

5．3 结果与讨论

5．3．1 酶活测定

5．3．2 HPLC检测图

5．3．3 分离纯化及检测结果

5．3．4 产物的红外光谱图分析

5．3．5 催化条件的优化

5．4 结论

第六章 米曲霉整体细胞催化合成AA2βG的初步研究

6．1 材料

6．1．1 菌种

6．1．2 培养基

6．1．3 主要试剂

6．1．4 主要仪器

6．2 实验方法

6．2．1 种子培养

6．2．2 合成反应

6．2．3 反应液处理

6．2．4 产物的HPLC检测

6．3 结果与讨论

6．3．1 底物浓度的影响

6．3．2 反应时间的影响

6．3．3 pH的影响

6．4 结论

结束语

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

待发表的论文

致谢

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