莱茵衣藻氢酶基因的克隆、重组异源表达及蛋白表征

摘要

氢酶是催化氢的氧化或质子还原的蛋白,在微藻产氢过程中扮演着关键角色。按其所含金属不同可分为[Fe-Fe]氢酶、[Ni-Fe]氢酶和不含金属原子的氢酶3种。[Fe-Fe]氢酶由于其独特的活性中心H-Cluster和具有远远高出其它2种酶的活性而倍受关注,当前研究最多的是绿藻中的[Fe-Fe]氢酶。由于绿藻[Fe-Fe]氢酶对氧极为敏感,当氧分压达到2％时,氢酶将很快失去活性,且稳定性较低。因此绿藻[Fe-Fe]氢酶对氧的敏感性已成为当前绿藻制氢技术的主要瓶颈。对绿藻氢酶蛋白进行定向蛋白质工程改造被视为增加其耐氧性的有效手段。
　　 本研究课题以莱茵衣藻CC-503(绿藻纲衣藻属,Chlamydomonas reinhardtii CC-503)为研究对象,经缺硫厌氧诱导产氢后,提取其总RNA,采用反转录PCR技术克隆得到氢酶基因hydAl及其成熟相关蛋白基因hydG,序列比对结果显示,获得的hydAl及hydG基因序列与NCBI报道完全一致。对表达载体pCD和目的基因分别进行双酶切后,构建氢酶基因与表达载体的重组质粒pCD-hydAl-hydG。将重组质粒转入大肠杆菌体内进行异源表达,分别对诱导时机,诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间4个表达条件进行了系统优化,最终确定氢酶蛋白在大肠杆菌体内的最佳表达条件为:在37℃,170 rpm恒温摇床中培养,当菌液OD600达到1.0-1.2时,降温至25℃,然后加入终浓度为1.5 mmol/L的IPTG诱导剂,25℃继续诱导表达7 h后离心收集菌体,可以得到较高的蛋白表达量,蛋白表达量达65.77 mg/mL。
　　 建立了Ni亲和色谱和G75凝胶过滤色谱两步结合的HydAl氢酶蛋白的纯化技术路线,获得了纯度为90％的HydAl氢酶蛋白。并分别对重组氢酶蛋白的分子量,二级结构,热稳定性和不同浓度盐酸胍下的稳定性进行了表征。结果发现:所表达的重组氢酶蛋白分子量大小为55 kDa左右,二级结构体现的a-螺旋结构的特征。HydAl蛋白随温度的升高逐渐变性,热变性温度Tm值为341 K(即68℃),且HydAl蛋白的热变性是不可逆的。HydAl蛋白在盐酸胍中的半数变性浓度D50％为3.58 mol/L。对HydAl蛋白与盐酸胍变性的动力学进行了初步考察,得出动力学反应为单指数反应,其速率常数k=869.57 s-1。本研究为进一步氢酶蛋白的定向进化改造奠定了重要的物质和方法基础。