海洋双壳类动物金属硫蛋白的提取与分析技术研究

摘要

金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)是一类低分子量、富含半胱氨酸的金属结合蛋白。由于水生生物体的MTs能被金属诱导，而且诱导程度与水环境重金属浓度之间存在一定的相关性，可间接反映出水环境中重金属的污染水平，因此，海洋动物体内的MTs已被认为是海水和沉积物重金属污染的生物标志物。而且海洋动物MTs含量还被认为是海洋金属暴露风险评价和健康评价的重要工具。近二十年来，为了将MTs应用于海洋污染的生物监测，国内外学者先后研究了多种分析技术及相应的提取方法。但是海洋动物MTs的分离和定量分析尚无国际性的标准方法，因此本研究以暴露于含镉海水的菲律宾蛤仔（Ruditapesphilippinarum）为试验材料，在文献报道的汞饱和法和分光光度法的基础上，分别对两种方法的提取和测定条件进行优化。
　　 对汞饱和法的优化，依次采用正交设计和单因素设计对内脏和鳃MT（以粗提液中的巯基含量表示）的提取工艺条件进行优化。所得到的内脏最佳匀浆条件为：Tris-HCl缓冲液浓度为0.02mol/L，pH值7.8，内脏与缓冲液的质量体积比(m/v)为1/5，其中，缓冲液的浓度对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4℃、20000g离心30min，再于80℃水浴加热10min，然后于4℃15000g离心10min。
　　 所得到的鳃最佳匀浆条件为：Tris-HCl缓冲液浓度为0.02mol/L，pH值7.8，内脏与缓冲液的质量体积比(m/v)为1/4，其中，缓冲液的pH对提取效果影响较大。最佳除杂条件为：匀浆液首先在4℃、25000g离心20min，再于80℃水浴加热10min，然后于4℃15000g离心10min。
　　 测定条件优化时，以菲律宾蛤仔的鳃组织为试验材料，逐一测定该方法的各因素对鳃组织Cd-MT提取液中汞含量的影响，由此得到汞饱和法测定双壳类MT的适宜条件为：将稀释4倍的Cd-MT提取液与Hg2+浓度50mg/L的10％三氯乙酸按等体积比混合后，孵化反应5min，再加入1.5倍体积的2％牛血红素溶液，迅速在20000g离心20min。经过优化的汞饱和法对蛤仔Cd-MT的相对标准偏差为4.95％，加标回收率为71.08％～78.86％，检出限为0.24μgHg/L，对应于4.47μgMT/g组织。
　　 对于分光光度法的优化，采用单因素设计分别对内脏和鳃MT（以粗提液中的巯基含量表示）的除杂工艺和测定条件进行优化。内脏除杂最佳工艺条件为：取1ml上清液加入1ml无水乙醇（-20℃预冷）和80μl氯仿，离心取上清液加入3倍体积无水乙醇-20℃沉淀1h，6000g离心10min后弃去上清液，取沉淀加1.74ml无水乙醇和260μ1Tris-HCl（含蔗糖）振荡冲洗沉淀，离心取沉淀，N2吹干得到MT干粉。最佳测定条件为：Ellman显色试剂中NaCl浓度为0.5mol/L。经优化的分光光度法测定内脏MT相对标准偏差为3.20％，加标回收率在90.09～96.85％之间，检测限9.98μgMT/g组织。
　　 鳃MT除杂阶段最佳工艺条件：取1ml上清液加入1ml无水乙醇（-20℃预冷）和40μ1氯仿，离心取上清液加入3倍体积无水乙醇-20℃沉淀1h，6000g离心10min后弃去上清液，N2吹干得到MT干粉。最佳测定条件：Ellman显色试剂中不含NaCl。经优化的分光光度法测定鳃MT相对标准偏差为2.92％，加标回收率在91.88～101.29％之间，检测限6.61μgMT/g组织。
　　 综上所述，相对于汞饱和法，分光光度法简单、重复性好、准确度高、成本低，试验器材容易获取，更适于一般实验室选用，且能保证结果的真实性与可靠性，可作为蛤仔等双壳类MT检测的可靠的分析技术。

目录

文摘

英文文摘

谨献

1 文献综述

1.1 引言

1.2 MT理化性质

1.2.1 组成

1.2.2 等电点

1.2.3 可诱导性

1.2.4 稳定性与光谱特性

1.3 MT在海洋环境重金属污染监测中的应用

1.4 海洋动物MTs的提取与纯化

1.4.1 提取技术

1.4.2 分离纯化

1.5 海洋动物MTs的检测技术

1.5.1 金属饱和法

1.5.2 巯基检测

1.5.3 蛋白质检测

1.6 研究目的和研究内容

1.6.1 研究目的

1.6.2 研究内容

2 汞饱和法测定MT的条件优化

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 材料

2.2.2 仪器

2.2.3 方法

2.3 结果与分析

2.3.1 提取条件优化

2.3.2 汞饱和法优化

2.4 本章小结

3 分光光度法测定MT的条件优化

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 材料

3.2.2 仪器

3.2.3 方法

3.3 结果与分析

3.3.1 除杂过程优化

3.3.2 NaCl浓度对测定结果的影响

3.4 本章小结

3.4.1 基于分光光度法的菲律宾蛤仔内脏MT提取与测定条件

3.4.2 基于分光光度法的菲律宾蛤仔鳃MT提取与测定条件

4 两种方法对蛤仔MT的测定结果比较

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 材料

4.2.2 仪器

4.2.3 方法

4.3 结果与分析

4.3.1 精密度、准确度和检测限测定

4.3.2 两种方法对相同样品MT的测定结果比较

4.4 本章小结

5 结论与展望

5.1 结论

5.1.1 汞饱和法的样品提取条件和测定条件

5.1.2 分光光度法的样品提取条件和测定条件

5.1.3 分光光度法比汞饱和法更适于蛤仔样品MT的测定

5.2 进一步研究方向

参考文献

致谢

个人简历

硕士期间发表论文情况