一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺

摘要

本发明公开了一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺，步骤为：（1）选取双壳贝类在清洁海水中暂养2~7天，剔除死亡贝类；（2）之后进行定向诱导；（3）开壳取肉，按比例加入缓冲溶液，提取液经加热处理去除杂蛋白；（4）提取液冷却后经筛网过滤去除沉淀物，上清液通过多级超滤、微滤、纳滤多元膜集成纯化系统脱除大分子、分离提纯及浓缩，获得MT粗品；（5）MT粗品经葡聚糖凝胶与离子交换层析联合分离纯化，后经干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。如此可以有效提高贝类体内的金属硫蛋白含量，并可以获得对重金属具有高效脱除作用，更为安全的海洋生物源高效重金属解毒剂产品。

说明书

技术领域

本发明涉及水产品的高值化开发技术领域，尤指以海洋双壳贝类为原料，经金属诱导，提取分离对重金属具有高效脱除作用的海洋生物源贝类金属硫蛋白。

背景技术

随着我国工业化的进程，工农业废水大量排放到自然水体中，造成近岸海域严重污染，其中重金属离子对水体污染极为严重。当环境受到重金属污染后，不但能够影响海洋生物的摄食、生长发育和繁殖等生理功能，还可在生物体内富集，并通过食物链进入人体构成潜在威胁，引起急慢性中毒，出现诸如“水俣病”、“骨痛病”、“白细胞减少”等公害疾病，严重危及人类健康和安全。因此，如何降低重金属对人体危害已成为目前亟待解决安全性问题之一。

重金属在生物体内自然排泄非常缓慢，使用解毒剂是防治中毒的根本措施之一，但这些解毒剂主要是依靠化学合成，往往存在水溶性差，生物利用度低，且伴有不同程度副反应。因此，如何找到一种天然高效的对重金属具有解毒作用的生物制剂就显得颇为重要。金属硫蛋白（metallothionein，MT）作为一类高度可诱导性的内源性蛋白，主要表现为体内必需金属元素的储运、代谢和精细调节以及非必需金属元素的解毒，对保护大脑、肝、肾等重要器官具有极其重要意义，在医学、化妆品、保健食品添加剂、环保等方面得到了广泛的应用。

目前，国内市场上常见的MT多数是从兔肝脏中提纯，由于MT原料需求特别，且有关兔肝MT的提取技术通常采用缓冲液提取、有机溶剂沉淀除杂、热变性除杂、乙醇沉淀MT等工艺，由于工艺中使用大量乙醇和氯仿，不但使生产工艺繁琐，尚无有效的方法能大量生产MT，致使MT的价格极其昂贵，而且污染环境，从而使其应用和研究受到限制，MT原料来源已成为制约该领域发展的瓶颈之一。

选择丰富的MT资源，简化纯化步骤，降低成本，特别是减少有毒溶剂的使用，是生产MT的关键问题。我国是世界贝类养殖大国，海水贝类养殖产量占海水养殖总产量的80%，海洋贝类产业是我国海洋产业的一个重要组成部分，但贝类加工发展一直停留在初级阶段，即使是产量和出口量较大的主要经济贝类，绝大多数也止步于前处理的加工阶段，贝类出口以附加值低的冷冻加工品为主，高附加值的精加工产品较少。底栖双壳类海洋动物由于其具有分布广，活动性低，对重金属有较强的生物累积能力而备受关注，双壳类海洋动物体内MT含量与环境中金属浓度具有一定的相关性，被作为指示水环境污染物暴露和毒性效应早期警报的主要生物标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺，可以有效提高贝类体内的金属硫蛋白含量，并可以获得对重金属具有高效脱除作用，更为安全的海洋生物源高效重金属解毒剂产品。

为实现上述目的，本发明的解决方案是：

一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺，其步骤包括：

步骤1、选取双壳贝类，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养2~7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类；

步骤2、双壳贝类暂养后，分别养殖于添加金属离子溶液的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加不同金属离子溶液的海水，诱导时间1~30天，海水温度维持10~25℃；

步骤3、双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，直接进入下一步工序；

步骤4、经匀浆处理的贝肉，按比例加入缓冲溶液，调节提取液pH至6.0～9.5，控制提取温度，搅拌提取0.5～6小时；

步骤5、提取液经加热处理去除杂蛋白，直接进入下一步工序；

步骤6、提取液冷却后经筛网过滤去除沉淀物，上清液通过多级超滤、微滤、纳滤多元膜集成纯化系统脱除大分子、分离提纯及浓缩，获得MT粗品；

步骤7、MT粗品经葡聚糖凝胶与疏水性离子交换层析联合分离纯化，后经干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

所述步骤1中，选取原料为双壳贝类，包括：牡蛎、贻贝、扇贝、蛤蜊。

所述步骤2中，添加的金属离子为水溶性好的锌盐、镉盐、铜盐、铬盐和硒盐；添加的金属离子浓度为质量体积浓度，即mg/L，锌离子浓度控制在0.5~40 mg/L，镉离子浓度控制在0.05~4 mg/L，铜离子浓度控制在0.02~1.3 mg/L，铬离子浓度控制在3~180 mg/L，硒浓度控制在0.04~2 mg/L。

所述步骤2中，金属诱导方式可为单种金属诱导，也可为多种金属同时混合诱导。

所述步骤2中，诱导海水盐度维持在15~35‰，诱导海水pH控制在6.5~8.5。

所述步骤3中，贝类开壳采用高温气流或冷冻处理方法。

所述步骤4中，经匀浆贝肉与缓冲溶液的质量体积比，即千克：升，为1:2～1:10。

所述步骤4中，采用的缓冲溶液为0.01～0.3mol/L的Tris-HCL或磷酸缓冲溶液或氯化钠溶液，提取温度控制在20～60℃。

所述步骤5中，提取液通过加热去除部分杂蛋白，加热温度为60℃，时间控制在30～60分钟。

所述步骤6中，提取液经150μm筛网过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离。

所述步骤7中，MT粗品经葡聚糖凝胶G75与疏水性离子交换层析联合分离纯化，后经干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

采用上述方案后，本发明采用的MT诱导提取工艺，改变了以往以兔肝等动物肝脏为原料制备MT时大量的有机溶剂乙醇及氯仿的使用，以及原料来源的限制，不仅降低了因添加这些试剂引起安全性的影响，而且降低了对于试剂后续的去除工艺，并选择丰富的双壳贝了作为MT原料来源，均降低了其产业成本。

另外，本发明建立海洋生物源MT产业化工艺技术，制备了相比目前主要依靠化学合成，存在水溶性差，生物利用度低，且伴有皮下紫斑、鼻牙龈出血加重、腹胀恶心、口角糜烂、发热皮疹等副反应的重金属解毒剂，获得更为安全高效的海洋生物源重金属脱除剂产品，同时改变贝类出口以冷冻为主的格局，增加产品附加值，促进贝类资源的高值开发具有至关重要的作用，贝类MT将是未来MT产业发展的一个重要方向。

具体实施方式

本发明揭示了一种海洋生物源高效重金属脱除剂贝类金属硫蛋白的诱导、提取分离工艺，其步骤包括：

步骤1、选取双壳贝类，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养2~7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类；所述的双壳贝类为牡蛎、贻贝、扇贝或蛤蜊等；

步骤2、双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有锌盐、镉盐、铜盐、铬盐或硒盐金属离子溶液的海水进行高效定向诱导，金属盐的添加方式为单种金属盐或多种金属盐，添加的锌离子浓度控制在0.5~40 mg/L，镉离子浓度控制在0.05~4 mg/L，铜离子浓度控制在0.02~1.3 mg/L，铬离子浓度控制在3~180 mg/L，硒浓度控制在0.04~2 mg/L，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加不同金属离子溶液的海水，添加的金属离子为水溶性好的锌盐、镉盐、铜盐、铬盐和硒盐；添加的金属离子浓度为质量体积浓度，即毫克：升（mg/L），锌离子浓度控制在0.5~40 mg/L，镉离子浓度控制在0.05~4 mg/L，铜离子浓度控制在0.02~1.3 mg/L，铬离子浓度控制在3~180 mg/L，硒浓度控制在0.04~2 mg/，诱导时间1~30天，海水温度维持10~25℃，诱导海水盐度维持在15~35‰，诱导海水pH控制在6.5~8.5；金属诱导方式可为单种金属诱导，也可为多种金属同时混合诱导；

步骤3、双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，按比例加入缓冲溶液，调节提取液pH至6.0～9.5，控制提取温度，搅拌提取0.5～6小时；经匀浆贝肉与缓冲溶液的质量体积比，即千克：升，为1:2～1:10；采用的缓冲溶液为0.01～0.3mol/L的Tris-HCL或磷酸缓冲溶液或氯化钠溶液，控制提取过程pH在6.0～9.5，提取温度控制在20～60℃，时间控制在0.5～6小时；贝类开壳采用高温气流或冷冻处理方法；

步骤4、提取液经加热处理去除杂蛋白，直接进入下一步工序；提取液可通过加热去除部分杂蛋白，加热温度为60℃，时间控制在30～60分钟，在小量的提取过程中，80℃加热5～10分钟，也可去除部分杂蛋白，考虑到实际工业生产中对于吨级提取液难以在短时间内进行升降温的控制，加热温度宜控制在60℃；

步骤5、提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品；

步骤6、MT粗品经葡聚糖凝胶及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

以下通过具体实施案例对本发明进行阐释，本发明的优点和特点将随着描述而更为清楚。但这些实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但是这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

实施例一：

选取双壳贝类牡蛎，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有40 mg/L锌盐的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间20天，海水温度维持20℃，诱导海水盐度维持在28‰，诱导海水pH控制在8.2。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:4，投入200L 0.25 mol/L Tris-HCL缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至9.0，30℃搅拌提取4小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例二：

选取双壳贝类扇贝，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养5天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有0.5mg/L镉盐的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间10天，海水温度维持18℃，诱导海水盐度维持在26‰，诱导海水pH控制在8.2。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:10，投入500L 0.05 mol/L 氯化钠缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至7.5，45℃搅拌提取2小时，提取液经60℃加热60分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例三：

选取双壳贝类蛤蜊，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养3天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有0.3mg/L铜盐的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间30天，海水温度维持22℃，诱导海水盐度维持在30‰，诱导海水pH控制在8.5。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:5，投入250L 0.15 mol/L 磷酸缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至8.5，55℃搅拌提取1小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例四：

选取双壳贝类贻贝，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养4天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有23mg/L铬盐的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间7天，海水温度维持10℃，诱导海水盐度维持在25‰，诱导海水pH控制在7.5。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:8，投入400L 0.10 mol/L Tris-HCL缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至7.5，45℃搅拌提取3小时，提取液经60℃加热40分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例五：

选取双壳贝类牡蛎，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有0.5mg/L硒盐的海水进行高效定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间10天，海水温度维持15℃，诱导海水盐度维持在18‰，诱导海水pH控制在7.0。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:4，投入200L 0.1mol/L 磷酸缓冲液（内含0.1 mol/L氯化钠溶液），用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至9.2，45℃搅拌提取6小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例六：

选取双壳贝类牡蛎，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有4mg/L锌盐、0.5mg/L镉盐、0.2mg/L铜盐、2mg/L硒盐及12mg/L铬盐的海水进行多种金属高效联合定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间15天，海水温度维持20℃，诱导海水盐度维持在28‰，诱导海水pH控制在8.0。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:4，投入200L 0.1mol/L Tris-HCL缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至9.2，40℃搅拌提取4小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例七：

选取双壳贝类扇贝，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有4mg/L锌盐及1.0mg/L镉盐的海水进行两种金属高效联合定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间14天，海水温度维持20℃，诱导海水盐度维持在32‰，诱导海水pH控制在8.5。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:7，投入350L 0.25mol/L Tris-HCL缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至8.6，45℃搅拌提取2小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例八：

选取双壳贝类贻贝，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有0.4mg/L硒盐及1.0mg/L镉盐的海水进行两种金属高效联合定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间10天，海水温度维持15℃，诱导海水盐度维持在28‰，诱导海水pH控制在8.0。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:4，投入200L 0.15mol/L 磷酸缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至8.0，35℃搅拌提取6小时，提取液经60℃加热30分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

实施例九：

选取双壳贝类牡蛎，利用海水清洗贝类表面附作物，后在清洁海水中暂养7天，保持连续通氧，及时剔除暂养期间死亡贝类。双壳贝类暂养后，分别养殖于添加含有2.5mg/L锌盐、2.0mg/L硒盐及24mg/L铬盐的海水进行两种金属高效联合定向诱导，期间保持自然光照，连续充气，根据水质情况更换添加金属离子溶液的海水，诱导时间15天，海水温度维持15℃，诱导海水盐度维持在18‰，诱导海水pH控制在6.8。双壳贝类经金属定向诱导，开壳取肉，匀浆后，称取匀浆原料50Kg，按原料与缓冲溶液的质量体积比为1:2，投入100L 0.3mol/L 氯化钠缓冲液，用盐酸和氢氧化钠控制提取液pH至9.0，30℃搅拌提取6小时，提取液经60℃加热60分钟去除杂蛋白。提取液冷却后经150μm筛网去除大颗粒沉淀物，提取液经过滤后，直接经过0.5um的陶瓷膜或平板膜进行过滤澄清，再经截留分子量50KD，5KD及1KD的卷式膜进行多级分离分离提纯及浓缩，获得MT粗品。MT粗品经葡聚糖凝胶G-75及疏水性离子交换层析填料分离纯化，后经冷冻干燥处理，获得高纯度海洋生物源MT产品。

本发明以廉价而丰富海洋水产贝类为原料，简化分离纯化步骤，提供一种高纯度海洋生物源MT的提取纯化分离工艺。本发明公开的MT提取工艺改变了以往以兔肝脏制备MT时大量的有机溶剂乙醇及氯仿的使用，不仅降低了因添加这些试剂引起安全性的影响，而且降低了对于试剂后续的去除工艺，均降低了其产业成本，同时采用丰富的贝类资源为MT原料，克服了制约MT产业发展的原料来源问题，并提升贝类高附加值产业的精深加工。相比目前主要依靠化学合成，存在水溶性差，生物利用度低，且伴有皮下紫斑、鼻牙龈出血加重、腹胀恶心、口角糜烂、发热皮疹等副反应的重金属解毒剂，通过该工艺可以获得高附加值、市场前景广阔，更为安全高效的海洋生物源重金属脱除剂产品。

需要说明的是上述实施案例仅仅是对本发明的较佳实施案例，并没有来限定本发明的保护范围，在上述技术方案的基础上所作出的等同替换或替代均属于本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。