文昌鱼miR-183和miR-216基因簇的表达模式和保守性研究

摘要

MicroRNAs(miRNAs)是近年来新发现的一种长度约为22个核苷酸的高度保守的内源性非编码小RNA。它们在后生动物基因组中普遍存在，是生物基因调控网络的重要组成。越来越多的证据表明，miRNAs在动物发育和人类疾病发生中发挥重要作用。它们广泛参与胚胎早期发育、器官形成、细胞增殖分化、细胞凋亡等生理过程，并对肿瘤发生有一定影响。
　　 miRNA基因簇(miRNA clusters)是指miRNA基因在染色体上紧密分布的现象。miRNA基因簇在动物中是较常见的现象，其在细胞基因表达调控的网络系统中发挥重要作用，比单个miRNA的调控模式更加复杂，功能作用更加高效。但相对于单个miRNA，miRNA基因簇在表达、功能和进化方面的研究仍处于起步阶段。因此，有必要对现有的miRNA基因簇进行深入研究。同时，对一些高度保守的基因簇进行研究，将有助于我们理解miRNA的起源与发生以及相关的动物类群的演化和发展。
　　 miR-183基因簇是一个在后口动物中高度保守的基因簇，在脊椎动物中编码miR-182、miR-96和miR-183这3个miRNAs，文昌鱼中则只有MiR-96和miR-183。miR-216基因簇，包含miR-216和miR-217两个miRNAs，是脊索动物特有的基因簇，不存在于无脊椎动物。本论文以经典模式动物--文昌鱼为研究对象，鉴定获得miR-183基因簇和miR-216基因簇各miRNAs基因，阐明这些miRNAs的组织分布及在胚胎中的表达规律，与其他生物的表达谱进行比较研究，结合前期靶基因的研究结果，以此推测其可能的功能以及在脊椎动物起源和演化中的意义。
　　 本研究从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)中鉴定获得了miR-183基因簇和miR-216基因簇，并对其在组织和胚胎中的时空表达模式及保守性进行了分析研究。
　　 首先，根据佛罗里达文昌鱼miR-183基因簇和miR-216基因簇各基因家族成熟序列及前体序列设计引物，鉴定获得了青岛文昌鱼miR-183基因簇和miR-216基因簇各成员相应序列。通过比较分析，miR-183基因簇和miR-216基因簇都保守存在于后口动物中。
　　 其次，应用实时定量PCR技术对miR-183基因簇和miR-216基因簇各家族成员在文昌鱼成体各组织中的表达情况进行了研究。结果表明，miR-183基因簇miRNAs在文昌鱼背神经管中表达量最高，在肝盲囊和脊索中的表达量较弱，在剩余其他组织中的表达量则较低；miR-216基因簇miRNAs在鳃中的表达量最高，肝盲囊中表达量次之，在剩余其他组织中的表达量很低。
　　 最后，应用原位杂交技术对miR-183基因簇在组织和胚胎中的表达进行了研究。整体胚胎原位杂交结果显示，miR-183基因簇miRNAs在早期胚胎及一天幼虫中均没有表达，在两天幼虫的背神经管中明显表达。组织切片原位杂交结果则显示，miR-183基因簇在背神经管、肝盲囊和鳃中表达。
　　 根据上述结果我们可以得出以下结论：miR-183基因簇和miR-216基因簇均表现出组织特异性表达，前者主要在背神经管中表达，后者主要在鳃和肝盲囊中表达；miR-183基因簇参与文昌鱼感觉神经器官的发育和功能，miR-216基因簇则可能与脊椎动物胰脏的起源有关。