基于靶序列环化的新型滚环扩增方法的建立及其应用

摘要

核酸扩增是一项基本的生物技术,在医疗、农业、环境监测和取证等各个方面有着不可替代的作用。传统的核酸扩增使用聚合酶链式反应,即 PCR技术。作为一种经典的扩增检测方法,同以其为基础发展而来的实时荧光定量 PCR(qPCR)技术,被广泛的应用于核酸的扩增与检测领域。但这一技术在食品领域应用时会出现易受污染产生假阳性,有聚合酶抑制剂时使用困难,背景核酸大量存在时灵敏度大幅降低等问题。这些缺点限制了 PCR直接用于检测食品中外源微生物。同时,作为一种变温扩增技术,PCR特异性的发挥需要精确的控温仪器,不符合基层现场快速检测的要求。因此需要开发一种新的核酸扩增技术,能够摆脱对精确控温仪器的依赖,同时能够从食品中检测出外源病毒和细菌,即能够在大量背景核酸存在的条件下特异性检测目标序列的存在,以达到在食品领域真正广泛应用的目标。
　　滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA),是一种在等温条件下就能特异性扩增目标片段的扩增技术,主要利用环状模板和具有链置换能力的DNA聚合酶环绕模板进行周期性的复制。常见技术应用为都以锁式探针 RCA(padlock-RCA)引发扩增。虽然灵敏度高,但也有单链探针不稳定、探针与模板容易错配、扩增产物并非目标序列而是互补的探针自身的缺点。针对于此,本文使用了一种全新的目标成环RCA(Target-circularization RCA,TC-RCA):利用限制性内切酶酶切样品,产生具有9 nt粘性末端的序列;其次,设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头,在连接酶的作用下同目标序列连接成环;利用具有链置换活性的 DNA聚合酶,在两条引物的作用下引发超分支-RCA(Hyper-branched RCA);最后,扩增产物再经过限制性内切酶酶切,得到扩增后的目的片段。在此基础上,利用高特异性的 DNA连接酶、生物素修饰接头、链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段,构建了磁珠辅助的 TC-RCA技术。该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列,从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系,特别适用于检测食品中有害微生物的存在。论文主要从以下几个方面研究建立特异性核酸检测方法。
　　(1)TC-RCA的可行性,证明了TC-RCA具有在无背景核酸条件下扩增目标DNA片段的能力,敏感度为6×104个拷贝分子。同时,接头能稳定结合于固相磁珠表面,并且设计的接头固定于固相表面后不影响连接与扩增,为 TC-RCA在芯片上实现目标成环等温扩增提供了技术支持和理论依据。
　　(2)TC-RCA可以在大量背景核酸中检测出目标序列,敏感度达到6×106个拷贝分子,但结果伴有非特异性扩增。使用连接忠实度较高的Taq DNA连接酶进行连接,没有能够达到提高特异性的目的。主要是由于Taq DNA连接酶在非正常的缓冲液条件下,区别错配能力降低所致。说明 TC-RCA已经初步具备成为一种新型检测方法的能力,同时为后续的实验提供了解决问题的思路和依据。
　　(3)通过磁珠辅助将扩增子与背景DNA和Taq DNA连接酶分离,同时结合其它条件的优化探索,使得磁珠辅助的 TC-RCA可以在高背景核酸存在的条件下特异性地扩增目的片段,敏感度为60个拷贝分子,并且没有任何非特异性扩增出现。经过对各个步骤的精简优化,检测结果24 h之内即可获得。磁珠辅助的TC-RCA通用性强,更适用于基层和现场快速检测。
　　(4)磁珠辅助TC-RCA适用于检测水产品中有害细菌,SYBR Green I染色结果表明该技术可以特异地检测出水产品中的外源细菌,最低检测限达到100个细菌基因序列拷贝分子。同其它检测水产品中有害微生物的方法相比,本方法不需要进行增菌实验,检测的结果可以直接反应食品被细菌污染的最初状态。同时反应不依赖精密控温仪器,常用水浴锅就满足检测要求,为基层现场快速检测食品中细菌提供了一种强有力的技术手段。

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0前言

0.1 核酸扩增技术的发展历史与研究现状

0.2 等温核酸扩增方法的研究进展

0.3 滚环扩增的研究进展与应用

0.4 固相滚环扩增检测技术

0.5 水产品中有害微生物的检测

0.6 本论文研究意义

参考文献

1. TC-RCA等温DNA扩增方法的初探

1.1 仪器与材料

1.2 TC-RCA扩增PCR产物酶切片段

1.3 TC-RCA优化接头扩增质粒酶切片段

1.4 TC-RCA在固相磁珠表面扩增质粒酶切片段

1.5 本章小结

参考文献

2. 高背景核酸条件下TC-RCA扩增目的DNA序列

2.1 仪器与材料

2.2 T4 DNA连接酶介导的从牡蛎基因组DNA中扩增质粒片段

2.3 Taq DNA连接酶介导的从牡蛎基因组DNA中扩增质粒片段

2.4 本章小结

参考文献

3. 磁珠辅助TC-RCA扩增技术的研究

3.1 仪器与材料

3.2 磁珠辅助Taq DNA连接酶介导的TC-RCA扩增

3.3 磁珠辅助TC-RCA扩增方法敏感度优化

3.4 磁珠辅助TC-RCA扩增方法效率的提升优化

3.5 本章小结

参考文献

4. 磁珠辅助TC-RCA检测水产品中的有害细菌

4.1 仪器与材料

4.2 磁珠辅助TC-RCA检测牡蛎基因组中细菌DNA

4.3 磁珠辅助TC-RCA检测牡蛎中有害细菌的侵染

4.4 本章小结

参考文献

论文结论

已发表学术论文

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