微流控系统同时定量检测单个肝癌细胞内的过氧化氢和一氧化氮的研究

摘要

细胞是有机体结构和生命活动的基本单位。要研究了解生命活动的规律,就必须以研究细胞为基础,考察细胞的结构和功能,探索细胞的生命活动。细胞内存在种类繁多、时空分布复杂的活性小分子,它们的水平、种类、含量与细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动息息相关。在不同种细胞甚至是同种细胞内化学组成、生物活性、以及对内外界刺激的响应等方面都存在很大的差异,因此细胞组分分析尤其是单细胞组分分析是非常重要的。 生命是一个完整的系统,在复杂的生物体中,生物分子组织和调控水平是相互关联的、互相依赖的,并受各种各样的生理和环境因素的影响。研究表明:细胞的增殖、分化、凋亡等各种活动均涉及不同内源性活性小分子(如活性氧、活性氮、活性氯、巯基化合物、氨基酸、葡萄糖、H+、金属离子、阴离子等)。当正常细胞处于外界刺激(如药物、毒素、电磁辐射等)的胁迫条件下,这些活性小分子在细胞内的含量会随着细胞对环境胁迫的应答而发生显著变化。而这些活性小分子浓度水平的显著变化对细胞生理过程相关蛋白、酶、细胞因子的表达产生影响,从而起到不同甚至相反的作用:一方面可以参与调控细胞对外来侵害的抵御、抑制和杀灭机制,使得细胞进行自我修复;另一方面又可以诱导细胞凋亡直至发生病变。正因为这些细胞内的活性小分子的浓度水平与细胞生理状态以及一些医学重大疾病的发生、发展等过程密切相关,为此,单细胞水平上活性小分子的快速检测与定量分析如何利用和发展各种仪器、方法从单细胞层面、分子水平上准确获取细胞中这些活性小分子的定量信息,就成为揭示活性小分子的分子机制、致病机理以及对疾病进行预警与诊治的前提,已经成为近年来多学科交叉研究的一个新领域。 活性氧自由基(ROS),如过氧化氢(H2O2),一氧化氮(NO),是生命活动过程中具有代表性的重要活性小分子,生物体内的活性小分子的含量、水平直接与生物/细胞的生理、病理相关。过氧化氢和一氧化氮之间相互作用可已转化成具有更高细胞毒性的单线态氧(1O2)。过氧化氢和一氧化氮作为信使分子,在神经系统发挥着重要的作用。因此单细胞内定性、定量检测单细胞内H2O2、NO,对于探究它们的生成机制、转化机理、生理作用和致病机理具有重要的理论意义和实用价值。 本论文主要是利用实验室设计合成新型绿色荧光探针及商品化的探针,并借助微流控芯片这个新的技术平台实现对单个肝癌细胞内活性氧自由基H2O2和NO的同时检测。本论文主要含有二部分,内容如下: 第一章是绪论,简要阐述了细胞内活性组分H2O2和NO的生物学意义、检测方法。对 第二章微流控分析系统在单细胞分析领域的研究进行了概述,主要包括单细胞进样、细胞溶膜、电泳分离、分离物检测等方面最新研究进展的简短介绍。 第二章,实验体系中选择由实验室内部自行合成的荧光探针二(对甲苯磺酰基)-二氯荧光素FS及商品化荧光探针DAF-FM DA(3-Amino,4-aminomethyl-2’,7’-difluorescein,diacetate)作为荧光标记试剂,以微流控芯片电泳-激光诱导荧光法作为分析技术平台,很好的完成了对单个贴壁系的细胞HepG2内H2O2和NO的同时定量检测。细胞经过前处理,探针孵育,重悬,调密度等过程后作为样品引入芯片通道,利用电动控制结合MCE-LIF在简单的十字芯片上自动化实现了对单个HepG2细胞内H2O2和NO的定量检测,其过程主要有:单细胞进样、单细胞捕获、单细胞溶膜、分析物的电泳分离检测。实验证明,这种方法具有简单、快速、易于实现、自动化和集成化程度高等优点。

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主要符号与缩写

第一章 绪 论

1 引言

2. 微流控芯片检测单细胞内过氧化氢和一氧化氮的研究进展

3 微流控分析系统

4本论文研究内容

参考文献

第二章 微流控系统同时定量检测定单个HepG2细胞内的H2O2和NO的研究

2 实验部分

3 结果与讨论

4 结论

参考文献

第三章 总结与展望

1 总结

2 展望

作者发表的学术论文及参加的课题

致谢