慢病毒介导的人p53基因过表达及稳定感染细胞系的建立

摘要

p53基因作为肿瘤抑制的关键基因，主要功能是修复与细胞周期G、S期有关的DNA损伤，并且在DNA损伤严重时诱导受损细胞的凋亡。因此，p53基因在维持基因组的稳定与预防癌症发生方面具有重要的作用。在等摩尔比例下，具有正确DNA结合结构域的野生型p53蛋白比突变型p53蛋白活性更强，野生型p53蛋白不仅可以抑制突变型p53蛋白的获得性功能，而且可以诱导由突变型p53蛋白引起的肿瘤细胞的凋亡。由于在所有恶性肿瘤中，该基因的突变率在50％以上。因此，p53基因及其表达产物可以起到预防肿瘤细胞发生和发展的重要作用。 本研究设计并构建了两种慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo，并将上述两种慢病毒载体和包装质粒（packaging plasmids）组成的包装系统共转染293T细胞，收集慢病毒颗粒并测定pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒的滴度。按实验设计流程将两种病毒感染靶细胞CF-1，利用G418筛选出稳定细胞系后收集细胞内蛋白质样品。然后，通过Western Blot实验对收集到的CF-1-p53细胞和CF-1-p53-PTEN细胞内的蛋白质样品进行检测。实验结果表明慢病毒介导的人p53基因在CF-1细胞系中能够过表达p53蛋白，并且慢病毒介导的人p53基因和PTEN基因共同导入CF-1细胞系中也能过量表达p53蛋白，但是与慢病毒介导人p53基因的单独导入CF-1细胞相比产生的p53蛋白较少。上述实验结果证明本研究成功建立了人p53基因稳定表达细胞系。 本研究还通过细胞计数法检测p53基因和PTEN基因表达后对细胞生长的影响。实验结果发现慢病毒介导的人p53基因的导入会对CF-1细胞的生长产生抑制作用，而慢病毒介导的人p53基因和慢病毒介导的PTEN基因的同时导入同样会对CF-1细胞的生长产生抑制作用，并且抑制细胞生长的程度比慢病毒介导的人p53基因单独导入的细胞更加强烈。上述实验结果表明，CF-1-p53-PTEN细胞系较CF-1-p53细胞系中p53蛋白的过表达量少，可能是因为PTEN基因与p53基因的同时过表达对细胞生长的抑制作用引起的。 综上所述，本论文成功构建了慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo，并利用G418筛选出pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒感染的稳定细胞系CF-1-p53和CF-1-p53-PTEN。通过Western Blot实验成功检测到两种细胞内p53蛋白的过量表达，并且利用细胞生长曲线的测定证明p53和PTEN基因的过量表达对CF-1细胞生长的影响。本论文为利用p53基因治疗癌症提供了重要的实验基础。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 综述

1 p53基因的发现

2 p53基因的分子结构及功能

2.1 p53基因的结构

2.2 p53基因的功能

3 p53基因抑制肿瘤发生和发展的作用机制

3.1 p53基因调节细胞新陈代谢的途径

3.2 p53调节细胞自噬

4 人p53基因临床治疗癌症的研究进展

4.1 利用人p53基因进行治疗的癌症类型

4.2 人p53基因相关药物的研发进展

5 选题依据与研究意义

第二章 人p53和PTEN基因的慢病毒表达载体的构建及病毒包装

前言

1 实验材料与试剂

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

2 实验方法

2.1 目的基因的获得

2.2 重组慢病毒载体的构建

2.3 慢病毒重组质粒DNA的制备

2.4 重组慢病毒的包装及收集

2.5 病毒滴度的检测

3 实验结果

3.1 重组质粒PCR鉴定结果

3.2 台盼蓝染色结果

3.3 病毒滴度计算及差异性分析

第三章 慢病毒感染稳定CF-1细胞系的构建及p53蛋白的表达分析

前言

1 实验材料与试剂

1.1 实验材料

1.2 实验试剂

2 实验方法

2.1 细胞培养

2.2 病毒感染

2.3 稳定感染细胞系的筛选

2.4 Western Blot实验检测蛋白质样品的含量

3 实验结果

第四章 人p53和PTEN基因过表达对CF-1细胞生长的影响

前言

1 实验材料和试剂

2 实验方法

3 实验结果

3.1 细胞生长曲线的绘制

3.2 细胞生长差异性比较

讨论

结论

参考文献

致谢