慢病毒介导shRNA稳定持续抑制口蹄疫病毒增殖的两类细胞系的建立

摘要

RNA干扰(RNAi)是广泛存在于生物界的一种由内源性或外源性双链RNA分子诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象,是许多生物具有的对抗入侵的核酸,保护自身的天然机制。诱发RNAi的最关键分子是长度为19～27bp的双链RNA,被称为小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)。随着RNAi机制及其应用研究的不断深入,人们发现无论体内还是体外试验,siRNA均能够抑制多种病毒的增殖。近年来,许多学者以人工诱导RNAi的方式进行了病毒复制的干扰研究,取得了良好进展,因此RNAi技术被认为是最有应用价值的抗病毒感染方法之一。
　　 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的多种偶蹄动物共患的急性传染病,被国际兽疫局列为A类传染病之首。由于口蹄疫病毒非常容易发生变异,导致新的变异株不断出现、更迭,传统的疫苗免疫等措施不能有效地应对口蹄疫的爆发和流行。RNAi现象的发现及其在抗病毒方面的研究进展,为FMD的防制研究开辟了一个新的探索领域。本研究针对口蹄疫病毒的体外复制进行了RNA干扰的成功探索。FMDV的2B和3D基因在FMDV不同血清型和亚型中非常保守,根据美国Invitrogen公司提供的siRNA在线设计结果,针对2B和3D区段设计并合成了5个shRNA模板,同时设计了一个无关对照shRNA模板,分别克隆到shRNA表达载体的U6启动子下游,构建了6个相应的shRNA表达质粒。
　　 首先,从细胞水平研究了shRNA表达载体对3D基因表达的抑制作用,将3D基因克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组的融合表达质粒pEGFP+3D。将针对3D基因的4个干扰质粒分别与pEGFP+3D共转染PK-15细胞,经荧光显微镜观察、流式细胞仪和real-time RT-PCR分析,表明pEN／U6-3D1、pEN／U6-3D2、pEN／U6-3D3和pEN／U6-3D4对3D基因的表达有一定的抑制作用,其中pEN／U6-3D2和pEN／U6-3D4的效果较为突出。
　　 然后将pEN／U6-3D2,pEN／U6-3D4,pEN／U6-2B和pEN／U6-CON进行LR重组生成对应的pEX／U6-3D2,pEX／U6-3D4,pEX／U6-2B和pEX／U6-CON。接着将重组后的表达载体在转染试剂介导下和辅助质粒一同转染293FT细胞,在转染后50h时收获慢病毒。将上述慢病毒转染原代羊胚胎成纤维细胞和PK-15细胞,48h时换成带有抗性的培养液进行筛选,14天左右的时间获得单克隆细胞株,扩大培养后保存各细胞株,其中FMDV特异性shRNA稳定表达细胞株6株,阴性对照shRNA稳定表达细胞株2株,提取上述细胞株的基因组经PCR鉴定确实为shRNA转基因阳性克隆。最后利用观察CPE、TCID50测定、间接免疫荧光试验和real-time PCR等方法检验了上述细胞株对FMDV增殖的抑制效果。结果显示,阴性对照克隆和未转基因的空白对照在接种病毒24h后,两株细胞克隆的感染率均比稳定整合FMDV特异性干扰序列的阳性细胞克隆的感染率高,并且二者差别显著。