绵羊肺炎支原体山东株的分离鉴定和标准株外膜蛋白特性研究

摘要

绵羊肺炎支原体(Myeoplasma ovipneumoniae，M．O)能够引起绵羊和山羊的传染性胸膜肺炎，并且同仅引起山羊传染性膜肺炎的丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoide subsp．capri)无交互免疫性。M．O自1982年首次在国内发现后，对我国养羊业造成了重大危害。本研究在M．O山东分离株鉴定的基础上，调查了山东省部分羊场的感染情况，并阐明了M．O标准株Y-98外膜蛋白的特性和探讨了快速诊断M．O的PCR方法，为山东省M．O感染的防治提供了一定的技术支持。 本研究共分四个部分： 第一部分绵羊肺炎支原体山东YG株的分离与鉴定从山东某羊场采集因传染性胸膜肺炎死亡的绵羊肺、胸腔渗出液等检样，应用Hartleys培养基进行病原体分离培养。将分离到的病原体采用微生物学、血清学、电镜观察方法及理化特性进行鉴定，结果表明，分离的病原体表现出同M.OY-98标准株完全相同的特征，故确定为绵羊肺炎支原体(命名为山东YG株)。将分离株经气管接种进行绵羊回归试验，出现与临床病例完全相同的症状，表明YG株M．O是造成绵羊发病和死亡的病原体。将YG株M．O接种到SPF鸡胚卵黄囊中，结果表明其可以在卵黄囊中生长，并且造成鸡胚的发育缓慢和死亡。用电镜观察，YG株M．O主要表现为二等分裂的繁殖方式，部分表现为出芽生殖。另外，观察到M．O的细胞膜呈三层结构，外面为绒毛状荚膜。 第二部分IHA对山东省部分羊场M．O的血清学调查使用M．OY-98株制备IHA诊断抗原，对山东省济南、莱芜、聊城和东营四地市7个羊场共898只不同品种、年龄的山羊和绵羊进行了血清学调查，以IHA效价2<'6>以上判为阳性。结果表明，各个羊场中均存在着的M．O感染，不同品种、年龄的羊只感染率不同。在898份被检血清中，阳性检出率为28.9％，其中绵羊和山羊的阳性率分别为32％和24．3％，表明绵羊阳性率明显高于山羊；一岁以下羊只阳性率为42.8％，明显高于其他年龄的羊只，说明此年龄羊只最易感：波尔山羊阳性率为48.3％，杜泊绵羊阳性率为47.9％，明显高于当地普通羊和杂交羊的22.5％和27.6％。 第三部分绵羊肺炎支原体外膜蛋白特性研究首先通过电镜观察到M．O细胞膜结构和荚膜的存在，然后采用TritonX-100裂解和0.6％KI提取的方法制备绵羊肺炎支原体Y-98株外膜蛋白，经12％SDS-PAGE分析，表明其分子量范围在14.4-125.9KD之间。分别制备抗Y98株全细胞抗原和外膜蛋白高免血清，经Western-blotting分析，表明外膜蛋白为绵羊肺炎支原体的主要保护性抗原，而在外膜蛋白的67.6KD、39.3KD和28.8KD多肽为其主要保护性抗原。利用间接ELISA方法对外膜蛋白引起的体液免疫功能进行测定，结果表明，膜蛋白能够诱导机体产生高效价的抗体，免疫后第7、14和28天抗体效价分别达到了1：2<'4.25>、1：2<'7.75>和1：2<'8.75>；利用MTT法对外膜蛋白引起的细胞免疫功能进行测定，结果表明，在免疫前0天及免疫后28天对T淋巴细胞刺激的转化率分别为8.46％和18.3％。以MDCK为研究载体，待MDCK贴壁生长后接种不同浓度的外膜蛋白和M.OY-98，细胞出现CPE或者脱落，而抗外膜蛋白高免血清可以有效地抑制CPE和细胞脱落的发生。 第四部分快速检测M．O的PCR方法的建立和初步应用根据GenBank发表的支原体保守序列，使用Primer6．0设计一对支原体的通用引物，扩增大小约为453bp的支原体保守序列。应用该引物对绵羊肺炎支原体Y-98、分离株YG、鸡滑膜支原体(MS)、鸡败血支原体(MG)、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌分别用该引物进行PCR扩增，结果表明，该引物能够从MOY-98、分离株YG、MS和MG中特异性扩增出453bp的片段，而不能从肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌中扩增出该片段。将M.ODNA进行倍比稀释，进行敏感性试验，结果表明该引物能够检测出1pg/ml浓度的DNA，具有较强的敏感性。分别以M.OY-98、分离株YG培养液、M.OYG接种致死的鸡胚卵黄囊为材料，进行PCR，结果表明，均能够特异性扩增出453bp的片段。

目录

论文说明：中英文缩略表

声明

引言

一、绵羊肺炎支原体病原学研究

二、绵羊肺炎支原体致病机理研究

三、肺炎支原体吸附器和外膜蛋白研究

四、绵羊肺炎支原体肺炎的流行病学研究

五、绵羊肺炎支原体的诊断、治疗和预防研究

六、本研究的目的、意义

试验一绵羊肺炎支原体山东YG株的分离和鉴定

1材料与方法

2结果

3讨论

试验二利用IHA对山东省部分羊场的绵羊肺炎支原体血清学调查

1材料与方法

2结果

3讨论

试验三绵羊肺炎支原体标准株Y98外膜蛋白成分分析及免疫试验

1材料与方法

2结果

3讨论

试验四绵羊肺炎支原体PCR诊断方法初探

1材料与方法

2结果

3讨论

结论

参考文献

致谢

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